分光光度法-血糖

1、 p31實驗四實驗四 分光光度技術與分光光度技術與 葡萄糖氧化酶法測定血糖葡萄糖氧化酶法測定血糖一、分光光度法一、分光光度法 分光光度法是根據不同物質對于不同分光光度法是根據不同物質對于不同波長的光波具有選擇性吸收的光學特性，波長的光波具有選擇性吸收的光學特性，建立起來的分析方法。建立起來的分析方法。（一）分光光度法的依據（一）分光光度法的依據I0It溶液溶液 當一定波長的光線通過某種當一定波長的光線通過某種透明介質透明介質時，時，其中一部分光可透過，一部分光被吸收，這種其中一部分光可透過，一部分光被吸收，這種某種溶液對一定波長的光的某種溶液對一定波長的光的吸收特性吸收特性可用于該可用于該物質

2、的物質的定性和定量分析定性和定量分析。分光光度計可獲得分光光度計可獲得單色光單色光 分光光度計利用棱鏡或光柵取得波長范圍分光光度計利用棱鏡或光柵取得波長范圍為幾個為幾個nm甚至更窄的單色光。甚至更窄的單色光。測定的時候需選擇不同物質測定的時候需選擇不同物質最大吸收峰所對應的波長最大吸收峰所對應的波長波長波長（nm ）光光吸吸收收值值最大吸收峰最大吸收峰分光光度計的優(yōu)點分光光度計的優(yōu)點 分光光度法的靈敏度、準確度及選擇性分光光度法的靈敏度、準確度及選擇性都很高，是一種最常用的靈敏、精確、都很高，是一種最常用的靈敏、精確、快速和簡便的分析方法。快速和簡便的分析方法。不同分光光度計的波長范圍不同分光

3、光度計的波長范圍紫外光紫外光(200-400nm)可見光可見光(400-760nm)紅外光紅外光(760nm-30m)（二）分光光度法原理（二）分光光度法原理 Lambert-beer定律，該定律闡明了溶液定律，該定律闡明了溶液對單色光吸收的多少與溶液濃度及液層厚對單色光吸收的多少與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比關系。度的乘積成正比關系。I0Itlg=KCLI0Itlg：光密度（光密度（O.D.），或稱吸光度（），或稱吸光度（A）I0：入射光強度入射光強度It：透過光強度：透過光強度K：吸光系數，它與該物質吸收光能力有關：吸光系數，它與該物質吸收光能力有關I0Itlg=KCLC：溶液濃度：溶液

4、濃度(mol/L)L：液層厚度：液層厚度(cm)（三）分光光度法計算待測溶液濃度的方法（三）分光光度法計算待測溶液濃度的方法1 1、利用標準溶液測定溶液的濃度、利用標準溶液測定溶液的濃度A標標= KC標標LA樣樣= KC樣樣LA標標A樣樣C標標C樣樣2 2、利用標準曲線求得待測溶液的濃度、利用標準曲線求得待測溶液的濃度標準曲線的制作：標準曲線的制作： 先配制一系列已知不同濃度的測定物標準先配制一系列已知不同濃度的測定物標準溶液，按測定管顯色，分別讀取各管光密度，溶液，按測定管顯色，分別讀取各管光密度，以各管光密度為縱坐標，各管濃度為橫坐標，以各管光密度為縱坐標，各管濃度為橫坐標，作圖得標準曲線

5、。作圖得標準曲線。濃度濃度吸吸光光度度以測定管的光密度從標準以測定管的光密度從標準曲線上可求得測定物濃度曲線上可求得測定物濃度（四）分光光度計的基本結構（四）分光光度計的基本結構1 1、光源、光源2 2、單色光器、單色光器3 3、吸收杯（比色杯）、吸收杯（比色杯）4 4、檢流計（測光系統(tǒng)）、檢流計（測光系統(tǒng)）752型分光光度計n1）A/T/C/F切換鍵n2）SD鍵具2個功能。傳輸數據；確認當前的F值。n3）/0%調T為000.0。n4)/100%調T 為100.0。轉換至A時，按鍵后顯示0.000。（五）操作規(guī)程（五）操作規(guī)程n1. 插上電源，打開電源開關預熱30min。n2. 將波長旋鈕旋至

6、所需波長。n3. 將樣品倒入比色皿放入比色皿架，空白管進入光路，按A/T/C/F鍵至光標于T位，開蓋按/0%鍵使讀數顯示000.0。關蓋，再按/100%鍵使讀數顯示100.0。按A/T/C/F鍵至光標于A位，再按/100%顯示0.000。拉出樣品管進入光路讀A。n4. 測定結束打開樣品室蓋。n5. 取出比色皿清洗干凈后用蒸餾水沖洗并倒扣在粗濾紙上晾干。 實驗目的實驗目的n了解葡萄糖氧化酶法測定血糖的基本原理。n掌握酶法測定血糖的實驗方法n熟悉分光光度計的使用。 P57二、葡萄糖氧化酶法測定血糖二、葡萄糖氧化酶法測定血糖n實驗原理：實驗原理：葡萄糖葡萄糖O2+H2O GOD 葡萄糖酸內酯葡萄糖酸

7、內酯2O222O2 + 4-氨基安替比林氨基安替比林+酚酚 POD 紅色醌類化合物紅色醌類化合物 + 2O +O2 用分光光度法將待測溶液與同樣處理的葡用分光光度法將待測溶液與同樣處理的葡萄糖標準液比色，求待測血糖濃度。萄糖標準液比色，求待測血糖濃度。儀器和藥品：儀器和藥品：n血清、血糖試劑盒n752可見紫外分光光度計。 基本操作基本操作n取三支試管，編號，下表加樣計算血糖濃度 編號試劑ml空白管標準管測定管血清0.02葡萄糖標準液(100mg/dl)0.02酚試劑1.51.51.5酶試劑1,51.51.5混勻后37度保溫15分鐘,在505nm波長處比色，顯色后2小時穩(wěn)定。吸量管的使用n拿吸量管正確姿勢n取液姿勢n卸放姿勢微量取樣器的操作n調至所需體積值；吸：垂直持取樣器用大拇指按至第一檔第一檔；將吸頭插入溶液松開大拇指，液面上升； 放：移出液面，按至第一檔繼續(xù)按至第二檔繼續(xù)按至第二檔以排空液體。n注意：移取另一樣品時， 更換新吸頭。