朱玉賢 分子生物學 第9章 原核基因表達調(diào)控

1、第九章第九章 原核核基因表達調(diào)控原核核基因表達調(diào)控Controlling of the Gene Expression of Prokaryote第一節(jié)第一節(jié) 基因表達調(diào)控概述基因表達調(diào)控概述DNARNA蛋白質復制轉錄翻譯逆轉錄RNA復制基因表達基因表達(gene expression)-基因轉錄及基因轉錄及翻譯的過程。翻譯的過程。rRNA、tRNA的合成屬于基因表達的合成屬于基因表達l 中心法則中心法則(the central dogma)：為什么基因功能要調(diào)控？為什么基因功能要調(diào)控？l 基因表達的時間性和空間性基因表達的時間性和空間性時間特異性時間特異性某一基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)

2、生某一基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生 Hb (hemoglobin) 22 22 22 2 2 2 22% 97% 1%2% 97% 1% - -樣亞基樣亞基 - -樣亞基樣亞基Each of the -like and-like globin gene families is organized into a single cluster that includes functional genes and pseudogenes.空間特異性空間特異性(spatial specificity) 在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序

3、出現(xiàn)同組織空間順序出現(xiàn) 同形異位現(xiàn)象同形異位現(xiàn)象( (homeosishomeosis): ): 果蠅頭部長觸角部位長出腳來果蠅頭部長觸角部位長出腳來 同形異位盒基因同形異位盒基因(homeobox) :高度保守的一段核苷高度保守的一段核苷酸序列（酸序列（180bp）,控制胚胎發(fā)育的基因控制胚胎發(fā)育的基因l 遺傳信息表達的方式遺傳信息表達的方式 組成型表達（組成型表達（constitutive expression）Housekeeping geneHousekeeping gene 誘導型表達誘導型表達 （inducible expression by signaling molecular

4、）Luxury geneLuxury gene 順、反因子間互作方式的基因表達調(diào)控順、反因子間互作方式的基因表達調(diào)控EpistasisEpistasis effect effectl 原核生物對環(huán)境的適應，相關的應答原核生物對環(huán)境的適應，相關的應答真核生物的細胞分化真核生物的細胞分化, , 組織特化組織特化 , , 個體發(fā)育個體發(fā)育以及環(huán)境對個體表型的影響都是以及環(huán)境對個體表型的影響都是基因表達的結果基因表達的結果l 基因表達的調(diào)控涉及基因表達的調(diào)控涉及RNA轉錄的開轉錄的開/關，數(shù)量，選擇性加工關，數(shù)量，選擇性加工蛋白質翻譯速率，數(shù)量，加工與蛋白質翻譯速率，數(shù)量，加工與 降解和分泌降解和分泌

5、l 原核生物與真核生物基因原核生物與真核生物基因 表達調(diào)控機制具有驚人的相似性表達調(diào)控機制具有驚人的相似性共同的起源與共同的分子基礎共同的起源與共同的分子基礎調(diào)控機理上調(diào)控機理上調(diào)控層次上調(diào)控層次上核酸分子間的互作核酸分子間的互作核酸與蛋白質分子間的互作核酸與蛋白質分子間的互作蛋白質分子間的互作蛋白質分子間的互作transcriptional levelposttranscriptional leveltranslational levelposttranslational level l 轉錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟轉錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟, 靈活，又是最為重要，復雜的調(diào)控靈活，又是最為重要

6、，復雜的調(diào)控 在復雜的基因組內(nèi)，確定需要基因轉錄的起始位點在復雜的基因組內(nèi)，確定需要基因轉錄的起始位點 精細調(diào)節(jié)基因表達的水平精細調(diào)節(jié)基因表達的水平, 以保證生物體對環(huán)境的適應以保證生物體對環(huán)境的適應 cis factor & trans factor 間嚴格而又靈活的互作間嚴格而又靈活的互作 保證保證RNA polymerase 的進行式轉錄的進行式轉錄 （不中斷，準確終止）（不中斷，準確終止）第二節(jié)第二節(jié) 原核基因調(diào)控機制原核基因調(diào)控機制內(nèi)容提要：操縱子學說操縱子學說原核基因調(diào)控機制的類型與特點原核基因調(diào)控機制的類型與特點轉錄水平上調(diào)控的其他形式轉錄水平上調(diào)控的其他形式 一、一、

7、操縱子學說操縱子學說1、操縱子模型的提出、操縱子模型的提出l 19401940年，年， MonodMonod發(fā)現(xiàn)細發(fā)現(xiàn)細菌的菌的“二次生二次生長曲線長曲線”。l 19511951年，年，MonodMonod與與JacobJacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因：合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因： Z Z基因基因：與合成：與合成-半乳糖苷酶有關；半乳糖苷酶有關； I I基因基因：決定細胞對誘導物的反應。：決定細胞對誘導物的反應。l SzilardSzilard：I I基因決定阻遏物的合成，當阻遏物存基因決定阻遏物的合成，當阻遏物存在時，酶無法合成，只有有誘導物存在，才能在時，酶無法合成，只有有誘導物存在，才能去掉該阻遏物

8、。去掉該阻遏物。l JacobJacob：結構基因旁有開關基因（：結構基因旁有開關基因（操縱基因操縱基因），），阻遏物通過與開關基因的結合，控制結構基因阻遏物通過與開關基因的結合，控制結構基因的表達。的表達。乙酰基轉移酶乙?；D移酶半乳糖苷半乳糖苷透性酶透性酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶操縱子操縱子2、乳糖操縱元、乳糖操縱元結構結構調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因Control elementStructural genes 調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白 結構基因不轉錄結構基因不轉錄 誘導物誘導物 結構基因轉錄結構基因轉錄調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白激活蛋白激活蛋白正轉錄調(diào)控正轉錄調(diào)控負轉錄

9、調(diào)控負轉錄調(diào)控二、二、 原核基因調(diào)控機制的類型與特點原核基因調(diào)控機制的類型與特點l 根據(jù)操縱子對調(diào)節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）根據(jù)操縱子對調(diào)節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的應答，的應答，可分為：可分為：正轉錄調(diào)控正轉錄調(diào)控和和負轉錄調(diào)控負轉錄調(diào)控可誘導調(diào)節(jié)可誘導調(diào)節(jié)：指一些基因在特殊的代謝物或化：指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ骱衔锏淖饔孟?，由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質的誘導下使基因活化。狀態(tài)，即在某些物質的誘導下使基因活化。 例：例：大腸桿菌的乳糖操縱子大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因分解代謝蛋白的基因l 根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它們

10、的小分子的應答，根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它們的小分子的應答，可分為可分為可誘導調(diào)節(jié)可誘導調(diào)節(jié)和和可阻遏調(diào)節(jié)可阻遏調(diào)節(jié)兩大類：兩大類：調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因阻遏蛋白阻遏蛋白誘導物誘導物mRNA酶蛋白酶蛋白酶合成的誘導酶合成的誘導操縱子模型操縱子模型誘導物如果某種物質能夠促如果某種物質能夠促使細菌產(chǎn)生酶來分解使細菌產(chǎn)生酶來分解它，這種物質就是誘它，這種物質就是誘導物。導物。例：例：色氨酸操縱子、色氨酸操縱子、合成代謝蛋白的基因合成代謝蛋白的基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因mRNAmRNA酶蛋

11、白酶蛋白調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因輔阻遏物輔阻遏物輔阻遏物（corepressor）如果某種物質能夠阻止細菌產(chǎn)生合成這如果某種物質能夠阻止細菌產(chǎn)生合成這種物質的酶，這種物質就是輔阻遏物。種物質的酶，這種物質就是輔阻遏物?？勺瓒粽{(diào)節(jié)可阻遏調(diào)節(jié)l 負轉錄調(diào)控系統(tǒng)負轉錄調(diào)控系統(tǒng)又可分為：又可分為：負控誘導：負控誘導：阻遏阻遏蛋白蛋白+誘導物誘導物結結構基因轉錄；構基因轉錄；負控阻遏負控阻遏：阻遏阻遏蛋白蛋白+輔阻遏物輔阻遏物結構基因不轉錄。結構基因不轉錄。l 正控系統(tǒng)又可分正控系統(tǒng)又可分為：為：正控誘導：正控誘導：誘導誘導物的存在使激活物的存在使激活蛋白處于活性狀蛋白處于活性狀

12、態(tài)；態(tài)；正控阻遏：正控阻遏：輔阻輔阻遏物遏物的存在使激的存在使激活蛋白處于非活活蛋白處于非活性狀態(tài)性狀態(tài)。第三節(jié)第三節(jié) 乳糖操縱子乳糖操縱子( (laclac operonoperon) )內(nèi)容提要：內(nèi)容提要：乳糖操縱子的結構乳糖操縱子的結構酶的誘導酶的誘導laclac體系受調(diào)控的證據(jù)體系受調(diào)控的證據(jù)乳糖操縱子調(diào)控模型乳糖操縱子調(diào)控模型影響因子影響因子LacLac操縱子中的其他問題操縱子中的其他問題一、一、 乳糖操縱子的結構乳糖操縱子的結構lacI, 1045bp，獨立，獨立PilacZYA二、二、 酶的誘導現(xiàn)象酶的誘導現(xiàn)象-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解底物的酶只有在底物存在時才出現(xiàn)！分解底物的酶

13、只有在底物存在時才出現(xiàn)！ 無乳糖時，幾個無乳糖時，幾個-gal/cell-gal/cell 加入乳糖時，加入乳糖時，50005000個酶分子個酶分子 再去掉乳糖，再去掉乳糖，laclac mRNA mRNA下降下降 乳糖能激發(fā)乳糖能激發(fā)lac mRNA的合成的合成 乳糖的誘導作用是由酶前體乳糖的誘導作用是由酶前體轉化而來，還是誘導新酶合轉化而來，還是誘導新酶合成？成？ 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（3535S-aa, S-aa, 無乳糖）無乳糖） E.coliE.coli繁殖繁殖培養(yǎng)基（無培養(yǎng)基（無3535S -S -aa, aa, 加入乳糖）加入乳糖） -gal(-gal(無無3535S) S)三、三、

14、調(diào)控機理調(diào)控機理體外結合競爭實驗體外結合競爭實驗: : 阻遏物阻遏物RNA RNA polpol, off, off RNA RNA polpol阻遏物，阻遏物， onon1. 阻遏狀態(tài)阻遏狀態(tài)2 誘導狀態(tài)誘導狀態(tài)誘導作用：在可誘導的操縱元中，誘導作用：在可誘導的操縱元中，加入對基因表達有調(diào)節(jié)作用的小分加入對基因表達有調(diào)節(jié)作用的小分子后，開啟基因的轉錄活性子后，開啟基因的轉錄活性3 誘導物不是乳糖！不是乳糖！生成生成lac誘導物誘導物乳糖代謝乳糖代謝Allolctose 異構乳糖異構乳糖 別乳糖別乳糖細胞內(nèi)細胞內(nèi)-半乳糖苷酶來源半乳糖苷酶來源?4、gratuitous inducer 安慰誘導

15、物安慰誘導物 義務誘導物義務誘導物 可誘導半乳糖苷酶產(chǎn)生，可誘導半乳糖苷酶產(chǎn)生，但不是其底物但不是其底物 IPTG，異丙基硫半乳糖苷異丙基硫半乳糖苷 X-gal, 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-半乳糖半乳糖（發(fā)色底物）（發(fā)色底物）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶去阻遏去阻遏葡萄糖葡萄糖+別乳糖別乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG 不是不是-半乳糖苷酶半乳糖苷酶可切割的底物可切割的底物 CH2OH CH3 HO O SCCH3 H CH3 OH HH H H OH圖16-6 異丙基-硫代半乳糖苷的分子結構四、四、 阻遏蛋白的作用機制阻遏蛋白的作用機制1、阻遏蛋白結構、阻遏蛋白結構38KD，4 聚體聚體

16、，一個亞基結合一個一個亞基結合一個IPTG分子分子lacI 組成型轉錄組成型轉錄 Pi 弱啟動子，弱啟動子， 510個個cell具有二重性具有二重性 阻止轉錄（與阻止轉錄（與lacO結合）結合） 開始轉錄（與開始轉錄（與誘導物誘導物結合）結合） 阻遏蛋白的阻遏蛋白的結構域結構域 頭段：頭段：-NH2端，端，lacO結合區(qū)（大溝）結合區(qū)（大溝） 絞鏈區(qū)：絞鏈區(qū)： 核心段：核心段：誘導物結合誘導物結合-COOH： 兩組亮氨酸兩組亮氨酸拉鏈，形成四聚體。拉鏈，形成四聚體。4個亞基的核心片段接觸形成四聚個亞基的核心片段接觸形成四聚體體阻遏蛋白單體的結構 Helix-turn-helix Core do

17、main1 Core domain2 1 51 80 360 DNA binding Hinge Inducer binding Oligomerization 圖 16- 阻遏蛋白單體的結構和功能 對稱軸，對稱軸，+11 對稱序列，對稱序列，6bp2、阻遏蛋白的結合位點、阻遏蛋白的結合位點lacO的結構的結構3、 組成型突變： lacOc cis-dominant組成型突變： lacI- lacIlacI- -/lacI/lacI細胞表型？細胞表型？ Repressor has lost lacI S genesythesizes Iducer-binding site defective

18、repressor that cannot bind inducer; it binds permanently to operator lacI S Operantor lacI + wild-type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 圖圖 16- Uninducible lac S mutations are dominant 3、不可誘導突變（超阻遏）：lacIs 等位基因間的互補等位基因間的互補（interallelic complementation）。 負的互補負的互補（negative comp

19、lementation） lacI-d的產(chǎn)物和的產(chǎn)物和lacI+的產(chǎn)物組成多聚體時，阻的產(chǎn)物組成多聚體時，阻遏蛋白無活性。遏蛋白無活性。 反式顯性反式顯性（trans-dominant） 顯性失活顯性失活（dominant negatives）Mutations map the regions of the lacl gene responsible for different functions. The DNA-binding domain is identified by lacI-d mutations at the N-terminal region; lacl- mutations

20、 unable to form tetramers are located between residues 220-280. Other lacI- mutations occur throughout the gene. lacIs mutations occur in regularly spaced clusters between residues 62-300. 4、阻遏蛋白對、阻遏蛋白對RNA pol功能的影響功能的影響 阻遏蛋白和阻遏蛋白和RNA RNA polpol可同時與可同時與DNADNA結合結合 RNA RNA polpol 與啟動子結合的平衡常數(shù)與啟動子結合的平衡常數(shù)

21、 1.91.910107 7 有阻遏蛋白時有阻遏蛋白時, 2.5, 2.510109 9 結合著的結合著的RNA RNA polpol不能轉錄不能轉錄. . 但加入誘導物后但加入誘導物后, , 釋放出阻遏蛋白釋放出阻遏蛋白, , 變?yōu)殚_放型啟動子復合物變?yōu)殚_放型啟動子復合物. . 阻遏蛋白實際上使阻遏蛋白實際上使RNA RNA polpol貯存在啟動子上。貯存在啟動子上。這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中？這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中？+ glucose- glucoseTime (hr)Units of -galactosidase+ lactoseGlucose added五、五、

22、lac operon的正調(diào)控的正調(diào)控 誘導物引起的阻遏物失活效應僅去掉阻遏誘導物引起的阻遏物失活效應僅去掉阻遏物并不能啟動物并不能啟動laclac基因表達基因表達, ,有其它因素參與有其它因素參與1、代謝物阻遏效應、代謝物阻遏效應 實驗：在實驗：在laclacGluGlu培養(yǎng)上培養(yǎng)上 E.coliE.coli只利用只利用G G，只有，只有G G 耗盡時，才會利用耗盡時，才會利用laclac葡萄糖抑制葡萄糖抑制lac mRNA的的轉錄：轉錄： 葡萄糖對葡萄糖對laclac操縱元表達操縱元表達的抑制是間接的的抑制是間接的 乳糖的降解是通過乳糖的降解是通過cAMPcAMP與與 CAPCAP結合起作用

23、的結合起作用的CAP, catabolite activator protein 由由crp編碼編碼（1 1）它可能直接和）它可能直接和RNA RNA PolPol相互作用；相互作用；（2 2） 作用于作用于DNADNA，改變其結構，從而，改變其結構，從而 幫助幫助RNA RNA PolPol結合。結合。 NH2 P P POCH2 ATP OH OH Glucose DNA Adenylcyclase Ihibition ? RNA pol + cyclic AMP + protein factor needed for NH2 transcription to tack place OCH

24、2 “ X” Protein factor Cyclic AMP (catabolite) RNA P O OH Stimulation Phosphodiesterase NH2 P OCH2 5AMP OH OH 圖 16- Control of catabolite-sensitive transcription through cyclic AMP + + + + + + + + 轉錄轉錄無葡萄糖，無葡萄糖，cAMP濃度高時濃度高時促進轉錄促進轉錄有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP濃度低時濃度低時不促進轉錄不促進轉錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAP2 2、CAPCAP的正

25、調(diào)控的正調(diào)控ATPATP腺甘酸環(huán)化酶腺甘酸環(huán)化酶cAMPcAMP（環(huán)腺甘酸）（環(huán)腺甘酸） 協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)（負性調(diào)節(jié)與正性調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)合作）（負性調(diào)節(jié)與正性調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)合作）結論：結論：lac操縱子強的誘導作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖操縱子強的誘導作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCo

26、me on, let me throughNo wayJose!CAPCAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.

27、Yipee!The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!3、

28、CAP結合位點結合位點 CAPCAP為二聚體，為二聚體， 45KD 45KD ，被，被cAMPcAMP激活激活 結合位點結合位點22bp I -70 -5022bp I -70 -50 II -50 -40 II -50 -40ARAR由于序列的差異，使不同基因受由于序列的差異，使不同基因受cAMPcAMP激激活的水平不同活的水平不同結合位點序列保守結合位點序列保守4、CAP的結合對的結合對DNA構型的影響構型的影響 DNADNA彎曲彎曲 彎曲點位于彎曲點位于CAPCAP結合位點二重對稱的中心結合位點二重對稱的中心 彎曲彎曲使使CAPCAP能與啟動子上的能與啟動子上的RNA RNA polpo

29、l 接觸接觸（1 1）CAPCAP結合位點與結合位點與轉錄起始點的位置轉錄起始點的位置 CAPCAP與與轉錄起始點轉錄起始點的距離，相距數(shù)個的距離，相距數(shù)個整雙螺旋整雙螺旋 CAPCAP結合位點在結合位點在啟啟動子動子的上下游，都的上下游，都能發(fā)揮作用能發(fā)揮作用5、CAP對轉錄的影響對轉錄的影響（2 2）基因轉錄對）基因轉錄對cAMPcAMPCAPCAP系統(tǒng)的依賴性，系統(tǒng)的依賴性， 與啟動子本身的效率有關與啟動子本身的效率有關cAMPcAMP-CAP-CAP復合物的結合，使位點復合物的結合，使位點II II附近的富含附近的富含GCGC區(qū)域雙螺旋結構穩(wěn)定性降低，因而區(qū)域雙螺旋結構穩(wěn)定性降低，因而

30、-10-10區(qū)的熔解區(qū)的熔解溫度降低，促進開放型啟動子復合物的形成溫度降低，促進開放型啟動子復合物的形成（3 3） CAPCAP激活轉錄的方式激活轉錄的方式 CAPCAP直接作用于直接作用于RNA RNA polpol 亞基亞基 缺失缺失RNA RNA polpol 亞亞基的基的C C末端時，失末端時，失去受去受CAPCAP激活的能力激活的能力 作用于作用于DNADNA，改變其改變其結構結構6.3.6 lac operon 的其它問題的其它問題1lac operon的功能是在的功能是在正負正負兩個調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用兩個調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinate regulation)下實現(xiàn)的。下

31、實現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉錄時，阻遏蛋白封閉轉錄時，CAPCAP不發(fā)揮作用；如沒有不發(fā)揮作用；如沒有CAPCAP加強轉錄，即使阻遏蛋白加強轉錄，即使阻遏蛋白從從P P上解聚仍無轉錄活性上解聚仍無轉錄活性CAP組成型合成，所以組成型合成，所以cAMPCAP復合物取決于復合物取決于cAMP含量含量腺苷酸環(huán)化酶位于細胞膜上，其活性與葡萄糖運輸?shù)南佘账岘h(huán)化酶位于細胞膜上，其活性與葡萄糖運輸?shù)拿赣嘘P，因此酶有關，因此cAMPCAP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖類代謝有關的酶糖等糖類代謝有關的酶降解物敏感型操縱元：只要有葡萄糖存在，這些操縱降解物敏感型操縱元：只要有葡萄糖存在，這些操縱

32、元就不表達元就不表達 2. A基因及其生理功能基因及其生理功能 編碼編碼B-半乳糖苷乙?；D移酶，使半乳糖苷乙?；Ｔ撁赴肴樘擒找阴；D移酶，使半乳糖苷乙?；?。該酶不參與乳糖代謝！不參與乳糖代謝！ 生理意義：在細胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖生理意義：在細胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質，其分解產(chǎn)物不能進一步代謝，積累，抑制細苷類物質，其分解產(chǎn)物不能進一步代謝，積累，抑制細胞生長。半乳糖苷乙酰化后，即無毒胞生長。半乳糖苷乙?；?，即無毒. 所以所以lacA雖不在乳雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質的積累糖降解中起作用，但可抑制有害物質的積累3. lac基因產(chǎn)物數(shù)量基因產(chǎn)

33、物數(shù)量， 1：0.5：0.2 不同酶的數(shù)量差異不同酶的數(shù)量差異,是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié)是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié). 方式有二方式有二:核糖體脫離核糖體脫離: 多順反子的差別性翻譯多順反子的差別性翻譯 內(nèi)切酶作用內(nèi)切酶作用: 在在lac mRNA分子內(nèi)部，分子內(nèi)部，a基因比基因比z基因更易基因更易受內(nèi)切酶作用受內(nèi)切酶作用4 4、操縱子的融合與基因工程、操縱子的融合與基因工程P OZYAtsxPOpur結構基因缺失lac operonpur operonSummarySummary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of

34、 lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthigh rate of expression6.4 色氨酸操縱子（trp operon）內(nèi)容提要：內(nèi)容提要： 色氨酸操縱子的結構色氨酸操縱子的結構 色氨酸操縱子的色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)阻遏系統(tǒng) 色氨酸操縱子的弱化機制色氨酸操縱子的弱化機制生物細胞中的氨基酸合成，生物細胞中的氨基酸合成， 也受操縱元的調(diào)節(jié)。細胞需要也受操縱元的調(diào)節(jié)。細胞需要某種氨基酸時，其基因即表

35、達，不需要時基因關閉，達到經(jīng)某種氨基酸時，其基因即表達，不需要時基因關閉，達到經(jīng)濟的原則。濟的原則。6.4.1 色氨酸操縱子的結構色氨酸操縱子的結構 調(diào)控基因調(diào)控基因 結構基因結構基因 催化分枝酸轉變?yōu)樯彼岽呋种λ徂D變?yōu)樯彼?的酶的酶trpRtrp 分支酸 鄰氨基苯甲酸 磷酸核糖基 CDRP 吲哚甘油-磷酸 色氨酸 鄰氨基苯甲酸 鄰氨基苯甲酸合成酶 吲哚甘油 色氨酸合成酶 硼酸合成酶 鏈 鏈 60，000 60，000 4 5，000 50，000 29，000 P O l a trpE trpD P trpC trpB trpA t t 1560 1620 1353 1191 804

36、36P：起動子；O：操縱子； l：前導序列； a：衰減子； t,t ：終止子 圖 16-15 E.coli trpO 的結構及其產(chǎn)物所催化的色氨酸合成反應磷 特點特點: : (1) (1) trpRtrpR和和trpABCDEtrpABCDE不連鎖；不連鎖； (2) (2) 操縱基因在啟動子內(nèi)操縱基因在啟動子內(nèi) (3) (3) 有衰減子有衰減子(attenuator)/(attenuator)/弱化子弱化子 (4) (4) 啟動子和結構基因不直接相連，二者被啟動子和結構基因不直接相連，二者被 前導序列前導序列(Leader)(Leader)所所隔開隔開 6.4.2 6.4.2 TrpTrp o

37、peronoperon 的阻遏系統(tǒng)的阻遏系統(tǒng)（1） Trp R 四聚體四聚體阻遏蛋白阻遏蛋白trp 有活性的阻遏物有活性的阻遏物 SNE299trp O 不轉錄不轉錄（2 2） 阻遏蛋白的結合位點阻遏蛋白的結合位點 trpO -21 +1，反向重復序列反向重復序列 trpP -40 +18 活性阻遏物與活性阻遏物與trpO 的結合與的結合與RNA pol與啟動子的結合與啟動子的結合發(fā)生競爭發(fā)生競爭（3 3） 阻遏系統(tǒng)阻遏系統(tǒng) 主管轉錄是否啟動，主管轉錄是否啟動， 在缺乏在缺乏Trp時，時， mRNA起始合成，但不能自動延伸，一般起始合成，但不能自動延伸，一般在在trpE之前終止轉錄之前終止轉錄

38、 粗調(diào)開關粗調(diào)開關6.4.3 弱化作用弱化作用 （attenuation）（1） 弱化子，衰減子，弱化子，衰減子， 前導前導RNA，140bp序列分析發(fā)現(xiàn)，其中4個片段進行配對，形成不同的二級結構TerminatorTerminatorS312POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons1432（2） 前導肽14aa（3 3）轉錄弱化作用）轉錄弱化作用Lack of trp Lack of trp Lack of aminoacyl tRNA Lack of aminoacyl tRNA Ribosome pause at trp Ribosome pause at trp

39、 codonscodons , occluding , occluding sequence 1sequence 1Form 2:3 hairpin Form 2:3 hairpin Transcription into trpE Transcription into trpE and beyond and beyond High trp High trp Trp is inserted at the Trp is inserted at the trp codons trp codons Translate to the end of Translate to the end of lead

40、er message leader message Ribosome occlude Ribosome occlude sequence 2sequence 2Terminate transcription at Terminate transcription at (3:4 form (3:4 form terminatorterminator) )弱化子對轉錄調(diào)控的關鍵 空間結構，空間結構，10th and 11th codons encode trp residues (rare AA) 時間，核糖體停頓在時間，核糖體停頓在2個個Trp 密碼子上時，產(chǎn)生延密碼子上時，產(chǎn)生延宕，宕， 此時

41、此時4區(qū)未轉錄出來區(qū)未轉錄出來The leader peptide is to determiner trp availability and to regulate transcription terminationsummary6.4.4 阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào) 阻遏效率阻遏效率 啟動子的轉錄起始頻率在啟動子的轉錄起始頻率在R+和和R-相差相差70倍倍 弱化作用弱化作用 trp存在時，約有存在時，約有10的的RNA pol僥幸轉錄僥幸轉錄 - trp 活性阻遏物活性阻遏物 無活性阻遏物無活性阻遏物 +trpNegativerepressible Negativer

42、epressible operonoperon可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏R P O leading seq. E D C B Atrp+為什么需要阻遏體系？為什么需要阻遏體系？ 當大量當大量Trp 存在時，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結存在時，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結合，阻止先導合，阻止先導mRNA合成。合成。 經(jīng)濟經(jīng)濟僅有少量僅有少量 trp時，時，RNApol啟動，啟動，但在但在L.S.處脫落，轉錄中斷處脫落，轉錄中斷R P O leading seq. E D C B A少量少量trp+不足以結合不足以結合 O 位點位點為什么需要弱化系統(tǒng)？為什么需要弱化系統(tǒng)？ 當

43、當trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)慢，不能很快引發(fā)trp 合成。因此需要一個能快速作出反應合成。因此需要一個能快速作出反應的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當?shù)牡南到y(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當?shù)腡rp水平。水平。6.4.5 細菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學意義細菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學意義 通過通過tRNA荷載與否進行調(diào)控，更為靈敏荷載與否進行調(diào)控，更為靈敏 氨基酸的主要用途是合成蛋白質，因而氨基酸的主要用途是合成蛋白質，因而tRNA 荷載為標準進行調(diào)控更為恰當荷載為標準進行調(diào)控更為恰當 兩個調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費提高效率兩個調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費提

44、高效率 阻遏系統(tǒng)阻遏系統(tǒng) 高水平高水平trp時，不轉錄時，不轉錄 低水平低水平trp時，轉錄至時，轉錄至LS 弱化系統(tǒng)弱化系統(tǒng) 細調(diào)細調(diào) 原核生物細致的精細調(diào)控機制原核生物細致的精細調(diào)控機制增強原核生物對環(huán)境的適應性增強原核生物對環(huán)境的適應性6.5 其他操縱子6.5.1 半乳糖操縱子半乳糖操縱子( (galactosegalactose operonoperon) )異構酶異構酶(galE)乳糖乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galT)半乳糖激酶半乳糖激酶(galk)。gal操縱子的特點：操縱子的特點： 它有兩個啟動子，其它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開可從兩個

45、不同的起始點開始轉錄；始轉錄； 它有兩個它有兩個O區(qū)，一個在區(qū)，一個在P區(qū)上游，另一個在結構基因區(qū)上游，另一個在結構基因galE內(nèi)部。內(nèi)部。6.5.2 阿拉伯糖操縱子（阿拉伯糖操縱子（arabinosearabinose operonoperon) ) araBaraB基因、基因、araAaraA基因和基因和araDaraD, , 形成一個基因簇，形成一個基因簇，簡寫為簡寫為araBADaraBAD 三個基因的表達受到三個基因的表達受到araara操縱子中操縱子中araCaraC基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物AraCAraC蛋白的調(diào)控。蛋白的調(diào)控。araara操縱子的調(diào)控有兩個特點：操縱子的調(diào)控有兩個特點：

46、 第一，第一，araCaraC表達受到表達受到AraCAraC的自身調(diào)控。的自身調(diào)控。 第二，第二，AraCAraC既是既是araara操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白（需操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白（需cAMPcAMP- -CRPCRP的共同參與，起始轉錄），又是其負調(diào)節(jié)蛋白。的共同參與，起始轉錄），又是其負調(diào)節(jié)蛋白。這種雙重功能是通過這種雙重功能是通過AraCAraC蛋白的兩種異構體來實現(xiàn)蛋白的兩種異構體來實現(xiàn)的（的（PiPi和和Pr)Pr)。6.5.3 阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應答SOS反應的機理：由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。LexA阻遏物：是SOS DNA修復系統(tǒng)所有

47、基因的阻遏物RecA蛋白：是SOS反應的最初的發(fā)動因子。在單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活，表現(xiàn)出水解酶活性，分解LexA阻遏物。當RecA水解LexA阻遏物后，導致SOS體系（包括recA基因）高效表達，DNA得到修復6.6.1 翻譯起始的調(diào)控 RBS（核糖體結合位點）：mRNA鏈上起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。 RBS的結合強度取決于SD序列的結構及其與起始密碼子AUG之間的距離。 SD- 4-10（9）-AUG6.66.6 轉錄后水平上的調(diào)控轉錄后水平上的調(diào)控6.6.2 稀有密碼子對翻譯的影響dnaG(引物酶) RNA引物dnaG、rpoD和rpsU屬于大腸桿菌基因組上

48、的同一個操縱子50個拷貝的dnaG蛋白、2800個拷貝的rpoD和40000個拷貝的rpsU幾種蛋白質中異亮氨酸密碼子使用頻率比較蛋白質AUU/%AUC%AUA%結構蛋白37621亞基26740DnaG蛋白363232細胞內(nèi)對應于稀有密碼子的tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程容易受阻，影響了蛋白質合成的總量。6.6.3 重疊基因對翻譯的影響重疊基因對翻譯的影響TrpB 谷氨酸- 異亮氨酸-終止 GAA - AUC - UGA - UGG - AA AUG - GAA 甲硫氨酸 谷氨酸t(yī)rpAtrpE蘇氨酸苯丙氨酸終止 ACU - UUC - UGA - UGG - CU AUG

49、AUG GCU 甲硫氨酸 - 丙氨酸- trpD 翻譯終止時核糖體立即處在起始環(huán)境中，這種重疊的密碼子保證了同一核糖體對兩個連續(xù)基因進行翻譯的機制。 6.6.4 反義反義RNARNA（antisense RNAantisense RNA）的調(diào)節(jié)作用）的調(diào)節(jié)作用u干擾干擾mRNA的互補的互補RNA ,可作為調(diào)節(jié)物質可作為調(diào)節(jié)物質 ？?。?！u 可與可與mRNA結合，結合， 結合位點是結合位點是S-D, AUG, 部分部分N端密碼子端密碼子 與與RNA形成雙螺旋結構，作為內(nèi)切酶底物形成雙螺旋結構，作為內(nèi)切酶底物 與轉錄產(chǎn)物結合，使轉錄提前終止與轉錄產(chǎn)物結合，使轉錄提前終止u 可以抑制基因的轉錄、可以

50、抑制基因的轉錄、RNA產(chǎn)物的加工或產(chǎn)物的加工或 mRNA的翻譯的翻譯 在細胞核和細胞質中都可以發(fā)生在細胞核和細胞質中都可以發(fā)生p 可以與靶可以與靶RNA形成雙鏈體形成雙鏈體p 雙鏈體阻遏翻譯起始，引起轉錄雙鏈體阻遏翻譯起始，引起轉錄終止，或產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶的作用終止，或產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶的作用位點位點p 在細胞核和細胞質中都可以發(fā)生在細胞核和細胞質中都可以發(fā)生u 小小RNARNA分子的翻譯調(diào)節(jié)分子的翻譯調(diào)節(jié)E coli 中外膜蛋白中外膜蛋白 ompF 的的 表達調(diào)控表達調(diào)控噬菌體，噬菌體，cII蛋白抑制晚期基蛋白抑制晚期基因轉錄因轉錄Tn10中轉座酶翻譯的調(diào)節(jié)中轉座酶翻譯的調(diào)節(jié)DNAanti-bfr

51、基因基因bfr基因基因anti-bfr RNAbfr mRNA RNARNA細菌鐵蛋白細菌鐵蛋白不存在不存在anti-bfr RNAbfr RNA失活失活bfr 編碼細菌鐵蛋白，正常轉錄編碼細菌鐵蛋白，正常轉錄mRNA其轉錄受到其轉錄受到Fur蛋白的調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)(Fur蛋白感受鐵離子的變化蛋白感受鐵離子的變化)例，例，細菌鐵蛋白用來儲存細胞中過剩的鐵離子細菌鐵蛋白用來儲存細胞中過剩的鐵離子培養(yǎng)基鐵離子濃度高時，需要細菌鐵蛋白培養(yǎng)基鐵離子濃度高時，需要細菌鐵蛋白E coli 中中 ompF 基因的翻譯調(diào)節(jié)基因的翻譯調(diào)節(jié)Env，編碼滲透壓感受器的受體蛋白編碼滲透壓感受器的受體蛋白ompC低滲時，

52、低滲時，ompC關閉，關閉，ompF增加增加高滲時，高滲時，ompC增加，增加，ompF下降下降ompC與與ompF是外膜蛋白，是外膜蛋白，受培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)受培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)6.6.5 RNA interference Gene silencing by dsRNAn植物植物：cosuppression (Rich Jorgensen, early 90s in 20th century )n真菌真菌： quelling (Cogoni et al, 1994)n動物：動物： RNA interfering Guo and Kemphues(1994): 向秀麗線蟲注向秀麗線蟲注射射pa

53、r-1基因的基因的antisense RNA，結果減弱了此基因，結果減弱了此基因的表達。但是，對照組注射的表達。但是，對照組注射sense RNA，也得到同，也得到同樣結果？！樣結果？?。?）The discovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811(Fire et al)Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationR

54、NAi現(xiàn)象的普遍性現(xiàn)象的普遍性n隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAiRNAi也存在水稻、煙草、果蠅及人等所也存在水稻、煙草、果蠅及人等所有的真核生物中。有的真核生物中。nRNAiRNAi能高效特醫(yī)的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體能高效特醫(yī)的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內(nèi)，內(nèi)，RNAiRNAi能達到基因敲處的效果。能達到基因敲處的效果。RNA-Mediated Gene Silencing轉基因沉默分為：轉基因沉默分為： 轉錄后水平的沉默（轉錄后水平的沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS) 轉錄水平的沉默（轉錄水平的沉默（Transcription

55、al Gene Silencing，TGS) RNAi屬于轉錄后水平的沉默。屬于轉錄后水平的沉默。DICER- RNAse III, 雙鏈特異性內(nèi)切酶- 二聚體, 2 催化域, 螺旋酶和 PAZ 基序- 產(chǎn)生 2-3nt 3突出末端- ATP依賴的核酸酶RISC- RNA-induced silencing complex- RISC 包含siRNA- 前體被ATP激活- 發(fā)現(xiàn)和破壞 mRNA的互補 序列- 含有內(nèi)切酶、外切酶, 切割 雜合鏈，緊接著降解之- ARO: PAZ domain (assembly)（2）RNAi的作用機制：的作用機制：siRNA形成階段形成階段RISC形成階段形成

56、階段效應階段效應階段沉默信號的放大與傳遞沉默信號的放大與傳遞RNAi 在組織間的傳遞在組織間的傳遞需要：需要： A) A) 從一個細胞到另一個細胞從一個細胞到另一個細胞 B) B) 信號進行放大信號進行放大A) SID, A) SID, 穿膜蛋白穿膜蛋白 ( (為信號運輸提供通道為信號運輸提供通道) )B) RdRPB) RdRP - RNA - RNA依賴的依賴的RNARNA聚合酶聚合酶 - - 存在于有些生物中存在于有些生物中 (drosophila, plants)(drosophila, plants) - - 通過擴增富集通過擴增富集siRNAsiRNA的濃度的濃度- siRNA -

57、 siRNA 為引物，靶為引物，靶mRNAmRNA為模板，合成為模板，合成 ds siRNA ds siRNARNAi放大信號放大信號dsRNARdRpDicermiRNARdRpdsRNATarget mRNARISCCleavage RNA degradation Transcriptional Gene Silencingplant: methylation in promotor regions leads to gene silencingMET as a part of RISCC.elegance: polycomb-dependent mechanism,polycomb proteins ass. with RISCchromatin remodeling: open close transitionsmall-temporal RNAslet7, lin4negative regulator of genes70nt precurser, processed by DICER, results not in dsRNAbind target and prevent ribosomal elongationRNA interference1、關于管家基因敘述錯誤的是、關于管家基因敘述錯