western-blot原理及操作流程1116

1、2016-11-16Western Blot實驗技術及常見問題分析Western blot 定義定義 Western Blot中文一般稱為蛋白質印跡中文一般稱為蛋白質印跡 通過聚丙烯酰胺電泳根據分子量大小分離蛋白后轉移到雜通過聚丙烯酰胺電泳根據分子量大小分離蛋白后轉移到雜交膜上交膜上 分離的蛋白可以通過一抗分離的蛋白可以通過一抗/ /二抗復合物進行檢測二抗復合物進行檢測 是蛋白質分析的最流行的技術之一是蛋白質分析的最流行的技術之一Western blot 原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）

2、上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。Western blot 原理Western Blot操作流程蛋白樣品的制備（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺 凝膠電泳（SDS-PAGE凝膠制備、上樣）l轉膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色 水溶液提取法 針對水

3、、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液 對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑 。 細胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 有機溶劑提取法 對于分子中非極性側鏈較多的蛋白質可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量(Bradford法 )原理考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅

4、色的溶液，與蛋白結合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。制作標準曲線 （插入表格）檢測樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測試。目前世界上最常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)Bradford法蛋白定量試劑盒（Bradford Protein Assay Kit) 。二、蛋白定量BCA蛋白濃度測定試劑盒BCA 法與傳統(tǒng)方法相比，更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。 BCA法測定蛋白濃度兼容

5、性亦很好，其不受大部分樣本中其他成分的影響，對于5%以內的SDS、Triton X-100、Tween 20、 Tween 80具有很好的兼容性。BCA法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑影響。在BCA法測定蛋白濃度前，應盡量使EDTA濃度m10M; DTT濃度1mM，2-ME0.01%。 BCA法在501000g/ml濃度范圍內有較好的線性關系， 其最小檢出量為25g/ml。 20-30 ug 細胞/組織裂解物 100 ng 純化蛋白根據蛋白表達豐度調整適當的蛋白上樣量上樣量一致：每孔上樣量保持一致上樣前用loading buffer加熱變性樣本三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質帶有負

6、電荷，因此電泳時可以從負極向正極移動蛋白質帶有負電荷，因此電泳時可以從負極向正極移動Anode -內槽緩沖液帶有負電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode +帶有負電荷的蛋白質從上到下運動（負極到正極），分開電泳進程可以根據前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比小分子量蛋白跑的比較快較快. . 蛋白根據分子蛋白根據分子量大小分開量大小分開標本加入到上樣孔中-濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜濾紙濾紙+四、Western Blot 轉膜 分離的蛋白通過電轉膜方式從凝膠中轉移到雜交膜上（PVDF或NC膜）PVDF膜：價格較貴，可重復使用，特別適

7、合蛋白印跡，結合能力較強，但價格比較昂貴。NC膜（硝酸纖維素膜）：價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。Western Blot 的具體步驟轉膜轉膜 轉膜準備轉膜準備制作制作“三明治三明治”“黑膠白膜黑膠白膜”Western Blot 的具體步驟轉膜轉膜 Western Blot 的具體步驟轉膜轉膜 轉膜條件：轉膜條件：推薦：推薦：100V ，12小時；根據蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。小時；根據蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。Western Blot 的具體步驟轉膜后檢測：（轉膜后檢測：（立春紅染色）立春紅染色） 1x立春

8、紅5min染色前染色后不能用于磷酸化蛋白！六、一抗、二抗孵育六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，室溫小時或4過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 室溫一小時或4過夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。uECL化學發(fā)光顯色 比較常用，結果容易控制，但是被催化是 靈敏度差一點uDAB顯色 比較靈敏，是HRP最敏感的底物Western Blot 需要的主要試劑主要試劑1.1.0mol/L TrisHCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g 蒸餾水 100ml 溶

9、解后，（用濃鹽酸調pH至6.8），室溫下保存。 2.1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.671g 蒸餾水 100ml溶解后，（用濃鹽酸調pH至8.8），室溫下保存。3.10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 如溶解困難，可在50水浴下溶解，室溫保存。 如在長期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10過硫酸胺（AP）過硫酸胺 0.1g 蒸餾水 1ml （現用現配，可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時加入蒸餾水水即可，溶解后，4保存，保存時間為1周）5 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4保存。

10、6 30%丙稀酰胺： 4 保存。7 5X電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。8 10X轉膜緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時稀釋10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產生沉淀）9 10XTBS緩沖液 Tris（MW121.14） 24.2g NaC

11、l 80.0g 蒸餾水至 1000ml （濃鹽酸調pH至7.6），溶解后室溫保存。 101XTBST緩沖液10XTBS緩沖液 100ml 蒸餾水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20比較粘稠，應緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產生氣泡。溶解后室溫保存。11封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)： 1XTBST緩沖液 95-100 ml脫脂奶粉 5g溶解后4保存，可于一周內使用。WB需要試劑膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜 主要目的是確定靶蛋白的分子量大??；使用預染的Marker還可以實時檢測電泳分離情況，并可以轉移到膜上。WB需要試劑蛋白質MarkerWB需要試劑

12、一抗選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體 根據說明書推薦的濃度優(yōu)化最佳稀釋比例 Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.選擇合適的一抗：選擇合適的一抗：雜交需要試劑二抗二抗選擇二抗選擇：根據一抗來源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適的二抗。二抗的使用二抗的使用：根據說明書推薦濃

13、度使用TBST稀釋二抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時。 Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.雜交需要試劑底物顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT化學發(fā)光底物：靈敏度高，需要曝光檢測設備（暗室、曝光設備和膠片）或者凝膠成像設備。結果分析使用

14、Photoshop 檢測灰度值使用graphpad做柱狀圖WB常見問題沒有信號高背景非特異性條帶條帶大小不對標本問題 l 標本中不含檢測蛋白：設置陽性對照l 上樣量不夠，或者蛋白表達豐度比較低：增加上樣量轉膜問題l 轉膜不完全：轉膜后使用麗春紅染色，確定目的大小蛋白條帶是否存在于膜上，使用蛋白質Marker.l 洗滌過度：減少洗滌時間和次數.封閉l 封閉過度：減少封閉試劑濃度，封閉時間，更換封閉試劑抗體孵育和檢測l 抗體濃度和時間孵育不夠：增加抗體濃度，延長孵育時間l 一抗不工作：設置陽性對照l 二抗不工作：和其他一抗配合檢測二抗是否工作l 一抗/二抗不匹配：檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗l 底物失活：重新配制有效的底物沒有信號沒有信號/ /弱信號弱信號背景高背景高封閉l 封閉時間不夠：延長封閉時間l 優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度l 封閉試劑和抗體有交叉反應：更換封閉試劑.l 磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑：推薦BSA封閉抗體孵育和檢測l 一抗/二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度l 孵育溫度太高：建議4度孵育過夜其他l 洗膜不充分：5*3mins，多次短時間的洗膜l 曝光時間過長：縮短曝光時間l 出現干膜現象：保證膜充分浸透，避免