分子雜交的概念及基本原理

1、分子雜交的概念及基本原理主要內(nèi)容：一、分子雜交的概念二、分子雜交基本原理（一）DNA變性：1、DNA變性的方法2、增色效應(yīng)3、溶解曲線4、融解溫度5、影響Tm值的因素。（二）復(fù)性：退火一、分子雜交的概念：分子雜交（molecularhybridization）指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA，在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。二、分子雜交基本原理：（一）DNA變性：DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而

2、發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。1、DNA變性的方法：1）加熱；2）改變DNA溶液的pH;3）有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。2、增色效應(yīng)：DNA在260nm處有最大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA變性，以溫度對紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。4、融解溫度：通常

3、人們把50%DN分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點對應(yīng)的溫度)，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，故又稱融點或融解溫度(meltingtemperature，Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時的溫度。5、影響Tm值的因素：Tm不是一個固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：1) 部因素：pH離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。2) 部因素：DNA勺堿基比例、DNA勺均一性；在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對含量高，其Tm值也高。6、DNA中的GC含量與Tm值關(guān)系：Tm=69。30。41X%(GC)對于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4(GC)2(AT)實驗表明DNA分

4、子中(GC)克分子含量百分比的大小與Tm值的高低呈直線關(guān)系。(二)復(fù)性：變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性(renaturation)。退火：通常DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低2530C左右時，變性后的單鏈DNA即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過程又叫做退火。復(fù)性后的DNA理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。影響復(fù)性速度的因素：1、DNA濃度：愈高，復(fù)性速度也愈快。2、DNA片段的大?。篋NA片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，使DNA片段線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的機(jī)會減少。因此，在復(fù)性實驗中，有時將DNA切成小

5、片段，再進(jìn)行復(fù)性。3、溫度：過高不利于復(fù)性。4、溶液的離子強(qiáng)度：通常鹽濃度較高時，復(fù)性速度較快。5、DNA順序的復(fù)雜性；簡單的分子復(fù)性很快，如polydT和polydA由于彼此互補(bǔ)識別很快，故能迅速復(fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA順序的復(fù)雜性。核酸探針主要內(nèi)容：一、探針的概念二、探針的種類極其選擇：1、DNA探針，2、cDNA探針，3、RNA探針，4、寡核酸探針三、各種標(biāo)記物極其選擇四、核酸探針的標(biāo)記方法五、雜交信號檢測一、探針的概念：放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）探針可用于分子雜交，雜交后通過

6、放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。二、探針的種類極其選擇：基因探針根據(jù)標(biāo)記物不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。1、DNA探針：DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之GC百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)

7、菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點： 這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。 不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。2、cDNA探針：cDNA（complementaryDNA）探針是指互補(bǔ)于mRN的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。cDNA探針是目前應(yīng)用最為

8、廣泛的一種探針。3、RNA探針：RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。克隆探針：前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆。32PdATP標(biāo)記。（二）、非放射性標(biāo)記：放射性標(biāo)記核酸探針在使用中的限制，促使非放射性標(biāo)記核酸探針的研制迅速發(fā)展，在許多

9、方面已代替放射性標(biāo)記，推動分子雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前已形成兩大類非放射標(biāo)記核酸技術(shù)，即酶促反應(yīng)標(biāo)記法和化學(xué)修飾標(biāo)記法。1、酶促反應(yīng)標(biāo)記法：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶促反應(yīng)將核苷酸分子摻入到探針分子中去1）標(biāo)記物-dUTP的生成：如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP。2）通過缺口平移法、末端加尾標(biāo)記和隨機(jī)引物延伸法將標(biāo)記物-dUTP作為大腸桿菌多聚酶I（DNA#I）的底物摻入到DNA分子中。2、化學(xué)修飾標(biāo)記法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上。如可通過連接臂將一個光敏基團(tuán)連接于生物素成為光敏生物素，在可見光的作用

10、下，與核酸形成穩(wěn)定的交聯(lián)，從而得到光敏生物素探針。五、雜交信號檢測：（一）放射自顯影：利用放射線在X線片上成影作用來檢測雜交信號，稱為放射自顯影。（二）非放射性核素探針的檢測：1、偶聯(lián)反應(yīng)：（1）半抗原通過抗原-抗體反應(yīng)與顯色體系偶聯(lián)。（2）配體親和法與顯色體系偶聯(lián)：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex，ABC2、顯色反應(yīng)：通過連接在抗體或生物素蛋白的顯色物質(zhì)如酶、熒光素等進(jìn)行雜交信號的檢測。（1）酶學(xué)檢測：是最常用的檢測方法，通過酶促反應(yīng)使底物形成有色產(chǎn)物。最常用的酶是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶，也有使用酸性磷酸酶和B-半乳糖苷酶。1）辣根過氧化

11、物酶（HRP）檢測體系：AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優(yōu)點為價廉、穩(wěn)定。（2）熒光檢測：常用的有異硫氰酸熒光素（FITC）和羅丹明，可被紫外線激發(fā)出熒光而被檢測到。主要應(yīng)用于原位雜交。（3）化學(xué)發(fā)光法：是指在化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的發(fā)光反應(yīng)。目前常用的是辣根過氧化物酶（HRP）催化魯米諾（luminol）伴隨的發(fā)光反應(yīng)。適合于Southern、Northern及斑點雜交。（4）電子密度標(biāo)記：利用重金屬的高電子密度、在電子顯微鏡下進(jìn)行檢測，適合于細(xì)胞原位雜交。核酸分子雜交的類型核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為液相雜交和固相雜交兩種類型。液相雜交：液相雜交指所參加反應(yīng)的兩條核酸

12、鏈都游離在溶液中。液相雜交是一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。固相雜交：固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條核酸鏈游離在溶液中。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，故該法最為常用。根據(jù)支持物的不同固相雜交又可為：濾膜雜交、菌落原位雜交和組織原位雜交。重點介紹：一、印跡雜交（一）印跡雜交技術(shù)的基本過程：（二）印跡轉(zhuǎn)移的方法（三）印跡雜交的類別及應(yīng)用1、Southern印跡雜交、2、N

13、orthern印跡雜交，二、斑點雜交、狹縫雜交，三、菌落原位雜交、四、組織原位雜交等。一、印跡雜交：（一）印跡雜交技術(shù)的基本過程：印跡雜交技術(shù)的原理首先由EdwenSouthern在1975年提出。其基本操作過程是：1、核酸的制備；2、電泳：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離；3、變性：置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈；4、印跡：禾U用吸水紙巾的毛細(xì)管作用，將單鏈DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80C烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上；5、預(yù)雜交：減少非特異性雜交反應(yīng)。6、雜交：7、洗膜：&檢測：（二）印跡轉(zhuǎn)移的方法：將凝膠中的核酸片段印跡到濾膜的方法有：1、虹吸印

14、跡法2、電轉(zhuǎn)移印跡法3、真空印跡法1、虹吸印跡法：利用毛細(xì)管的虹吸作用由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動核酸分子轉(zhuǎn)移至濾膜上。電泳后的凝膠一變性一中和一放置一室溫轉(zhuǎn)移1520h一漂洗-80C烘烤2h固定核酸2、電轉(zhuǎn)移印跡法：利用電泳作用將凝膠中的DNA專移至濾膜上，是一種快速、簡單、高效的轉(zhuǎn)移法，只需幾小時，特別適用虹吸轉(zhuǎn)移法不理想的大片段的轉(zhuǎn)移。電轉(zhuǎn)移法使用的濾膜有一定的限制，只能用尼龍膜或化學(xué)活化膜，不能用硝酸纖維素膜。因為硝酸纖維素膜結(jié)合DNA依賴于高濃度鹽溶液，高鹽溶液的導(dǎo)電性極強(qiáng)，產(chǎn)生強(qiáng)大的電流，使轉(zhuǎn)移體系的溫度急劇升高，破壞DNA3、真空印跡法：利用真空泵將轉(zhuǎn)移緩沖液從上層容器中通過凝膠抽到下層真空

15、室中，同時帶動核酸分子轉(zhuǎn)移到凝膠下面的濾膜上，整個過程只需1小時左右。（三）印跡雜交的類別及應(yīng)用：1、DNA印跡雜交技術(shù)：Southernblotting2、RNA印跡雜交技術(shù)：正好與DNA相對應(yīng)，故被趣稱為Northernblotting3、蛋白質(zhì)印跡雜交技術(shù)則被稱為Westernblotting。其中最常用的是用抗體來檢測，也稱為免疫印跡技術(shù)（immunoblotting）。1、DNA印跡雜交技術(shù)：DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)（Southernblotting）。基因組DNA-限制性內(nèi)切酶-DNA變性電泳一印記轉(zhuǎn)移-預(yù)雜交一（探針）一雜交一

16、洗膜一放射自顯影或化學(xué)顯色。2. RNA印跡雜交：這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。RNA的提取-RNA變性電泳-印記轉(zhuǎn)移-預(yù)雜交一（探針）-雜交-洗膜-放射自顯影或化學(xué)顯色。1）RNA分子較小，不需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割；2）在進(jìn)樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH因為它會水解RNA的2-羥基基團(tuán)；3）在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫；4）在膠中不能加EB因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合；5）操作均應(yīng)避免RNase的污染。二斑點雜交（Dotblot）：將核酸樣品變性后直接點樣于濾膜上，烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，然后與探針進(jìn)行雜

17、交的方法稱斑點雜交或狹縫雜交。斑點印跡為斑點狀，狹縫印跡為線狀。斑點雜交耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。三菌落原位雜交：菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。四.組織原位雜交：（一）原理：組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位

18、雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。（二）應(yīng)用：1、對致密染色體DNA勺原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；2、對分裂期間核DNA勺雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；3、與細(xì)胞RNA勺雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布；4、原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。（三）探針選擇：用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA也可以是RNA探針。通常探針的長

19、度以100400bp為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（1630bp）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。（四）探針的標(biāo)記：探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最為常用。3H標(biāo)記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低。35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好。32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。（五）組織與細(xì)胞的固定：原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因

20、素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0。2mol/LHCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進(jìn)一步完善和提高核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化（一）探針的選擇：根據(jù)不同的雜交實驗要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。1、檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核苷酸探針；2、在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡

21、核苷酸探針也可；3、檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體應(yīng)選用特異性較強(qiáng)的長的雙鏈DNA探針；4、組織原位雜交應(yīng)選用寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80150bp）,因為它易透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。（二）探針的標(biāo)記方法：在選擇探針類型的同時，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時，還應(yīng)考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更咼的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率咼、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。（三）探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針