中藥與制藥微生物學(xué)實驗

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗室規(guī)則醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗室規(guī)則一.進入實驗室必須穿白大衣,不必需的物品不要 攜帶入室。 二.保持實驗室的安靜和秩序,實驗要嚴(yán)肅認真。三.如有傳染性材料的污染,及時報告老師。四.實驗過程中有儀器和器材的損壞要報告老師 并登記。五.實驗后的材料要放到指定的位置。六.離開實驗室前,要用肥皂洗手,接觸過傳染性強 的實驗材料要用0.1%的新潔爾滅泡手1-2分鐘七.值日生要作好值日工作,關(guān)好水,電,門窗,作好 實驗記錄本的登記方可離開實驗室。目的要求目的要求: 1、了解微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備、了解微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備 2、了解空氣、皮膚細菌檢查方法、了解空氣、皮膚細

2、菌檢查方法 3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法實驗一實驗一 藥品的微生物限度檢查（一）藥品的微生物限度檢查（一） 實驗室常用消毒滅菌設(shè)備實驗室常用消毒滅菌設(shè)備 空氣和皮膚細菌檢查方法空氣和皮膚細菌檢查方法一一.藥品的微生物限度檢查（一）藥品的微生物限度檢查（一）1.口服藥物的微生物檢查口服藥物的微生物檢查: 大腸桿菌的檢查：大腸桿菌的檢查： 細菌總數(shù)的檢查細菌總數(shù)的檢查2.外用藥物的微生物檢查外用藥物的微生物檢查: 綠膿桿菌的檢查：綠膿桿菌的檢查： 金黃色葡萄球菌的檢查：金黃色葡萄球菌的檢查： 口服藥口服藥外用藥外用藥藥品的微生物限度檢查實驗方法藥品的微生物

3、限度檢查實驗方法（一）（一） 1.藥品的預(yù)處理藥品的預(yù)處理2克藥品加克藥品加20毫升生理鹽水，毫升生理鹽水，研磨制成懸液研磨制成懸液 2.細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng)外服藥外服藥口口用藥用藥藥品混懸液藥品混懸液10毫升加入毫升加入膽鹽乳糖膽鹽乳糖增菌液中增菌液中藥品混懸液藥品混懸液10毫升加入毫升加入膽鹽乳糖膽鹽乳糖增菌液中增菌液中藥品混懸液藥品混懸液10毫升加入毫升加入亞碲酸鈉亞碲酸鈉增菌液中增菌液中37,24小時小時37,24小時小時 將剩余將剩余口服藥口服藥以以10-1 10-2 10-3 10-4 進行稀釋進行稀釋( (以生以生理鹽水稀釋理鹽水稀釋) ) 3.細菌總數(shù)測定細菌總數(shù)測定加加溶化的瓊脂

4、培養(yǎng)基溶化的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，冷卻后中，混勻，冷卻后,置置37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時小時 。取三個中試管取三個中試管各管加各管加9ml生理鹽水生理鹽水從剩余從剩余10ml懸液中懸液中取取1ml加入第一個稀釋管中加入第一個稀釋管中1ml10-110-410-210-39ml生理鹽水生理鹽水從上述三個稀釋管中各取從上述三個稀釋管中各取1ml1ml10-110-410-210-3二二.空氣、皮膚細菌檢查方法空氣、皮膚細菌檢查方法(驗證驗證)三三.微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備： 高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋 消毒煮沸器消毒煮沸器 G6玻璃濾菌器裝

5、置玻璃濾菌器裝置 潔凈工作臺潔凈工作臺 移動式移動式 紫外光燈紫外光燈 鼓風(fēng)式干烤箱鼓風(fēng)式干烤箱 紫外線殺菌標(biāo)本。紫外線殺菌標(biāo)本。厭氧工作站厭氧工作站催化劑（鈀粒）催化劑（鈀粒）厭氧培養(yǎng)罐厭氧培養(yǎng)罐電熱恒溫培養(yǎng)箱電熱恒溫培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱一、目的要求一、目的要求: 1、了解細菌培養(yǎng)接種技術(shù)、了解細菌培養(yǎng)接種技術(shù) 2、掌握細菌基本形態(tài)、掌握細菌基本形態(tài) 3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（二）藥物的微生物限度檢查（二）2.空氣、皮膚細菌檢查結(jié)果測定?？諝狻⑵つw細菌檢查結(jié)果測定。3.講授基礎(chǔ)培養(yǎng)基的

6、制備方法講授基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯）。（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯）。4.培養(yǎng)基的種類和用途培養(yǎng)基的種類和用途 普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基5.細菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法細菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法(基本技能基本技能)液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基 雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基6.顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察 細菌的基本形態(tài)細菌的基本形態(tài): 球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。 特殊結(jié)構(gòu)：特殊結(jié)構(gòu)： 肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風(fēng)芽胞。

7、肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風(fēng)芽胞。實驗二實驗二 藥品的微生物限度檢查（二）藥品的微生物限度檢查（二） 細菌的形態(tài)學(xué)檢查及培養(yǎng)接種技術(shù)細菌的形態(tài)學(xué)檢查及培養(yǎng)接種技術(shù)一、一、空氣、皮膚的細菌檢查結(jié)果空氣、皮膚的細菌檢查結(jié)果1、記錄空氣微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人所在實驗臺的、記錄空氣微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人所在實驗臺的結(jié)果）結(jié)果） 菌落大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）菌落大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）2、記錄皮膚微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人的實驗結(jié)果）、記錄皮膚微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人的實驗結(jié)果）比較消毒前后細菌菌落數(shù)，菌落特點。比較消毒前后細菌菌落數(shù)，菌落特點。二、培養(yǎng)基的制備二、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基

8、分類培養(yǎng)基分類根據(jù)物理性狀分類：根據(jù)物理性狀分類： 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 主要用于增菌主要用于增菌 半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 用于檢測動力及保存菌種用于檢測動力及保存菌種 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 用于分離鑒定細菌用于分離鑒定細菌根據(jù)用途分類：根據(jù)用途分類： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基 營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基 血液瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 SSSS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基 厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基 庖肉培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備程序培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配調(diào)配矯正矯正pH（7.0-7.6）分裝分裝 滅菌（滅菌（121.3，20

9、-30分鐘）分鐘）放入冰箱冷藏備用。放入冰箱冷藏備用。 因高壓之后因高壓之后pH值會下降值會下降0.1左右，所以矯正左右，所以矯正pH時應(yīng)比時應(yīng)比所需的所需的pH高。高。 鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37 培養(yǎng)培養(yǎng)24小時，然小時，然后觀察。后觀察。方方 法法1.平板劃線接種法平板劃線接種法（1）平行劃線法）平行劃線法（2）分區(qū)劃線法）分區(qū)劃線法2.瓊脂斜面的接種方法瓊脂斜面的接種方法3.液體培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法4.半固體接種法半固體接種法平行劃線法分區(qū)劃線法菌落斜面移種技術(shù)菌苔液體移種技術(shù)穿刺技術(shù)穿刺技術(shù) 取出前次實驗培養(yǎng)物觀察：取出前次實驗培養(yǎng)物觀察： 1.

10、1.口服藥物口服藥物1)1)細菌鑒定：細菌鑒定： 在膽鹽乳糖增菌液中有無細菌生長：在膽鹽乳糖增菌液中有無細菌生長： 增菌液變混濁增菌液變混濁有有 -接種在接種在伊紅美蘭伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)基 上面。上面。 方法：分區(qū)劃線接種。方法：分區(qū)劃線接種。 2)2)細菌總數(shù)測定：細菌總數(shù)測定： 選擇選擇30-30030-300個菌落平板，個菌落平板， 細菌總數(shù)菌落數(shù)細菌總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)藥物的微生物限度檢查方法（二）2.2.外用藥外用藥1)1)判定判定膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物及及亞碲酸鈉增菌液培亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物養(yǎng)物有無細菌生長：有無細菌生長： 增菌液變混濁增菌液

11、變混濁有有2)2)細菌鑒定：細菌鑒定：（1 1）將）將膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物無菌接種在無菌接種在1616烷三甲烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上面。上面。 方法：斜面化線接種；方法：斜面化線接種；（2 2）將）將亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物，無菌接種在，無菌接種在卵黃高卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上面。上面。 方法：分區(qū)劃線接種。方法：分區(qū)劃線接種。 3737恒溫孵育箱恒溫孵育箱2424小時培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。小時培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。細菌基本形態(tài)細菌基本形態(tài)球菌球菌桿菌桿菌螺形菌螺形菌葡萄球菌葡萄球菌鏈球菌鏈球菌大腸埃希菌枯草桿菌霍亂弧菌細

12、菌特殊結(jié)構(gòu)細菌特殊結(jié)構(gòu)鞭毛莢膜芽孢破傷風(fēng)梭菌一、目的要求一、目的要求: 1、了解細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察、了解細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察 2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（三）藥物的微生物限度檢查（三）2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察 1）液體培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基-沉淀、渾濁、表面生長現(xiàn)象。沉淀、渾濁、表面生長現(xiàn)象。 2）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。 3）雙糖含鐵培養(yǎng)基）雙糖含鐵培養(yǎng)基-

13、動力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。動力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。 4）結(jié)核桿菌菌落的觀察。）結(jié)核桿菌菌落的觀察。3.中草藥、抗生素抑菌試驗中草藥、抗生素抑菌試驗 1）中草藥）中草藥-大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。 2）抗生素）抗生素-青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。實驗三實驗三 藥品的微生物限度檢查（三） 微生物的形態(tài)學(xué)檢查及藥物的敏感性試驗 1）從）從伊紅美蘭伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上瓊脂平板培養(yǎng)基上- 挑取挑取黑色帶有金屬光澤黑色帶有金屬光澤的的濕潤濕潤菌落，接種在菌落，接種在普通瓊脂斜普通瓊脂斜面面培養(yǎng)基上面，進行細菌的

14、培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)純培養(yǎng)。 2）觀察）觀察外用藥物外用藥物在在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上生培養(yǎng)基上生長狀況。長狀況。 記錄被檢菌色素的溶解性質(zhì)、液化明膠的狀況及菌苔粘稠記錄被檢菌色素的溶解性質(zhì)、液化明膠的狀況及菌苔粘稠度等。度等。 革蘭氏染色鏡下革蘭氏染色鏡下觀察其菌落形態(tài)。觀察其菌落形態(tài)。 根據(jù)上述被檢菌落的生物性質(zhì)和狀況及細菌形態(tài)，確定該根據(jù)上述被檢菌落的生物性質(zhì)和狀況及細菌形態(tài)，確定該被檢菌的名稱。被檢菌的名稱。 3）從）從卵黃高鹽卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上生長，挑取瓊脂平板培養(yǎng)基上生長，挑取黃色的濕潤黃色的濕潤菌落，菌落，接種在接種在普通瓊脂斜面普

15、通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進行細菌的培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)純培養(yǎng)。藥物的微生物限度檢查（三）藥物的微生物限度檢查（三）2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察混濁生長混濁生長菌膜菌沉淀均勻渾濁對照菌膜生長菌膜生長腸道桿菌雙糖鐵培養(yǎng)基結(jié)果比較葡萄糖乳糖硫化氫大腸桿菌副傷寒桿菌痢疾桿菌革蘭染色步驟革蘭染色步驟 1.制片：制片：取標(biāo)本取標(biāo)本（球桿混合物、牙垢）球桿混合物、牙垢）涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定 2.初染初染：結(jié)晶紫：結(jié)晶紫1min水洗水洗 3.媒染：媒染：碘液碘液1min水洗水洗 4.脫色：脫色：95% 酒精酒精30s水洗水洗 5.復(fù)染：復(fù)染：沙黃沙黃1mi

16、n水洗、濾紙吸干水洗、濾紙吸干 6.油鏡觀察油鏡觀察：1、制片、制片涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定2.結(jié)晶紫初染結(jié)晶紫初染 1min水洗水洗3. 碘液媒染碘液媒染 1min水洗水洗4. 95% 酒精脫色酒精脫色 30s水洗水洗5.沙黃復(fù)染沙黃復(fù)染 1min水洗、濾紙吸干水洗、濾紙吸干6.油鏡觀察油鏡觀察結(jié)果 革蘭陽性菌：紫色革蘭陽性菌：紫色 革蘭陰性菌：紅色革蘭陰性菌：紅色3.中草藥、抗生素抑菌試驗中草藥、抗生素抑菌試驗 紙片法實驗四實驗四 藥物的微生物限度檢查（四）藥物的微生物限度檢查（四） 病毒和細菌及其他病原微生物病毒和細菌及其他病原微生物一、目的要求一、目的要求 1、了解抗酸染色方法

17、及各種病毒和細菌的菌落形態(tài)、了解抗酸染色方法及各種病毒和細菌的菌落形態(tài) 2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容二、實驗內(nèi)容 1、藥物的微生物限度檢查（四）、藥物的微生物限度檢查（四） 1）將）將口服藥物口服藥物中的細菌分別接種：中的細菌分別接種：蛋白胨水培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基； 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基； 枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。 同時接種同時接種產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)氣桿菌于上述培養(yǎng)管做對照，以備進行于上述培養(yǎng)管做對照，以備進行IMViC試驗。試驗。 2）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基

18、上面的外用藥物外用藥物中細菌進行中細菌進行血漿凝固酶血漿凝固酶檢測檢測,依依 據(jù)據(jù) 其反應(yīng)結(jié)果其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。確定該菌的性質(zhì)及名稱。2 、抗酸染色、抗酸染色3 、真菌培養(yǎng)物的觀察、真菌培養(yǎng)物的觀察-黑曲霉、木霉黑曲霉、木霉 、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲，、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲， 酵母菌菌落的觀察。酵母菌菌落的觀察。4 、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗結(jié)果、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗結(jié)果 5 、觀察雞胚的結(jié)構(gòu)、觀察雞胚的結(jié)構(gòu)生化反應(yīng)管生化反應(yīng)管待檢細菌待檢細菌對照菌對照菌(產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)氣桿菌)蛋白胨水培養(yǎng)蛋白胨水培養(yǎng)基基2支管支管接種接種1支管支管接種接種1支管支管葡萄糖蛋

19、白胨葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基水培養(yǎng)基4支管支管接種接種2支管支管接種接種2支管支管枸櫞酸鹽培養(yǎng)枸櫞酸鹽培養(yǎng)基基2支管支管接種接種1支管支管接種接種1支管支管接種細菌的對應(yīng)生化反應(yīng)管接種細菌的對應(yīng)生化反應(yīng)管血漿凝固酶試驗血漿凝固酶試驗 玻片法玻片法抗酸染色抗酸染色原理:結(jié)核分枝桿菌含脂質(zhì)多結(jié)核分枝桿菌含脂質(zhì)多,不易著色不易著色,若加溫或延長若加溫或延長時間使其著色后時間使其著色后,再用再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色鹽酸酒精處理也不易脫色,稱稱抗酸染色抗酸染色. 經(jīng)此染色后經(jīng)此染色后,結(jié)核分枝桿菌呈紅色結(jié)核分枝桿菌呈紅色,其它呈藍其它呈藍色色.步驟抗酸染色抗酸染色i. i.制片（涂片、干燥、固定）；制

20、片（涂片、干燥、固定）；ii.ii.石炭酸復(fù)紅初染石炭酸復(fù)紅初染（加熱、加熱、 蓋濾紙片） 5min - -水洗；水洗；iii.3鹽酸酒精脫色鹽酸酒精脫色 （ 15S,15S,水洗）；水洗）；iv.iv.美蘭復(fù)染（美蘭復(fù)染（1min，水洗 ）- -濾紙吸干濾紙吸干v.v.鏡檢。鏡檢?？顾崛旧襟E抗酸染色步驟結(jié)核桿菌抗生素體外抑菌試驗（二） 記錄紙片法結(jié)果記錄紙片法結(jié)果測量抑菌環(huán)直徑測量抑菌環(huán)直徑 病毒的分離培養(yǎng)雞胚接種 動物接種 雞胚培養(yǎng) 組織細胞培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)方法：病毒的培養(yǎng)方法：病毒的分離培養(yǎng)雞胚接種病毒名稱病毒名稱接種部位接種部位雞胚胚齡（天）雞胚胚齡（天）痘類病毒痘類病毒絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜10101313流感、副流感、腮腺流感、副流感、腮腺炎病毒炎