3-羥基丙酸合成過程中關(guān)鍵途徑的構(gòu)建及優(yōu)化

1、3-羥基丙酸合成過程中關(guān)鍵途徑的構(gòu)建及優(yōu)化3-羥基丙酸(3-hydroxypropionicacid,3-HP)是乳酸的羥基異構(gòu)體,是合成很多醫(yī)藥化工中間體的重要前體物質(zhì),具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的問題是其產(chǎn)量還未達(dá)到工業(yè)化水平,因此構(gòu)建性能優(yōu)良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大腸桿菌EscherichiaColiBL21(DE3)為出發(fā)菌株,構(gòu)建了合成3-HP的代謝路徑,引入了甘油脫水酶再激活因子GDFW輔酶NAD再生途徑,并在基因組上為合成乙酰CoA的基因acs更換了trc強(qiáng)啟動子,最后對構(gòu)建的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)3-HP能力進(jìn)行了考察，具體研究

2、內(nèi)容如下:1.克隆來源于KlebsiellapneumoniaeDSM2026甘油脫水酶基因dhaB及再激活因子基因gdrA,采用不同的表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETDuet-dhaB1-4、pET28a-dhaB1-4和pCDFDuet-dhaB1-4;E.coliBL21(DE3)(pET-28a-dhaB1-4/pETDuet-dhaB1-4/pCDFDuet-dhaB1-4)甘油脫水酶酶活依次為11.56U/mg、7.94U/mg和6.94U/mg。同時克隆表達(dá)來自Cupriavidusnecator的醛脫氫酶基因GabD4,得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-GABabD4。與實驗室

3、前期構(gòu)建的含有Azospir川umbrasilense的內(nèi)源性基因a-酮戊二酸半醛脫氫酶的重組質(zhì)粒pCDFDuettac-Tukgsadh比較,酶活分別為E.coliBL21(DE3)pCDFDuet-tacTUkgsadh:3.11U/mg,E.coliBL21(DE3)pCDFDue-tac-GabD4:1.71U/mg。共表達(dá)得到工程菌株E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacTUkgsadh/pET-28a-dhaB1-4)、E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacTUkgsadh/pETDuet-dhaB1-4)、E.coliBL21(DE3)(pCD

4、FDue-tacGabD4/pET28a-dhaB1-4)和E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacGabD4/pETDuet-dhaB1-4)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h,3-HP的最高產(chǎn)量分別為0.37g/L、1.14g/L、0.31g/L和0.86g/L。說明使甘油脫水酶和醛脫氫酶分別在不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒上表達(dá)來平衡二者的酶活,更適合3-HP的合成。2. 為提高3-HP的產(chǎn)量,進(jìn)一步優(yōu)化了其合成途徑,包括甘油脫水酶再激活因子和輔酶NAD再生途徑的引入以及乙酰CoA啟動子的更換。克隆來源于K.pneumoniaeDSM2026中的甘油脫水酶再激活因子基因gdrB,構(gòu)建了E.c

5、oliBL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tacdhaB-gdrAB),在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h后3-HP產(chǎn)量提高到5.12g/L,相較之前提高了4.5倍。與前期構(gòu)建的輔酶再生的串聯(lián)重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCDFDuet-tac-sthA-TUkgsadh共表達(dá)后,搖瓶發(fā)酵38h后,結(jié)果顯示添加了輔酶再生基因后的工程菌，3-HP的產(chǎn)量反而降低，通過分析發(fā)現(xiàn)3-HP產(chǎn)量降低的主要原因是表達(dá)sthA和gpd1兩個基因后,由于代謝途徑中氧化還原力的不平衡導(dǎo)致途徑中缺乏NAD+從而降低了醛脫氫酶的活性。除此之外，乙

6、酰CoA合成過程中可以通過三竣酸循環(huán)經(jīng)氧化磷酸化釋放出大量的ATP供細(xì)胞生長和物質(zhì)合成，因此本實驗采用CRISPR-Cas9因編輯系統(tǒng)將合成乙酰CoA基因acs的啟動子替換為trc強(qiáng)啟動子,構(gòu)建了E.coliBL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB),該工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)38h后,3-HP產(chǎn)量達(dá)到5.5g/L,菌株生長狀況良好,提前達(dá)到了穩(wěn)定期。3. 以工程菌E.coliBL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuettac-dhaB-gdrAB)為出發(fā)菌株，優(yōu)化了5L發(fā)酵罐中3-HP的發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中控制pH穩(wěn)定在7.0,3-HP產(chǎn)量為8.79g/L,比pH不控制的情況提高了68%在pH恒定為7.0的基礎(chǔ)上,在甘油濃度下降至15g/L時開始添加,并維持甘油濃度在15-20g