第三章理化檢測(食用菌粗蛋白雜質)介紹

1、可溶性糖類的檢測可溶性糖類的檢測(還原糖還原糖蔗糖蔗糖總糖總糖)(一)還原糖的測定u費林熱滴定法(SP法)鐵氰化鉀法u薩氏薩氏(Somogyi)(Somogyi)法法(費林法測糖) 蔗糖（無還原性）蔗糖（無還原性）果糖果糖+ +葡萄糖（還原性）葡萄糖（還原性） 非還原性糖酸水解還原性單糖 按還原糖法測定按還原糖法測定 酸本身存在的還原性單糖（1）滴定必須在沸騰條件下進行不能把錐形瓶從熱源上取下來滴定可以加快還原糖與的反應速度；保持反應液沸騰可防止空氣進入，避免次甲基藍被氧化而增加耗糖量。（2）不能隨意搖動錐形瓶 以免空氣進入反應液中，使亞甲基藍被氧化項目三 產品 理化指標檢測模塊六模塊六 食用

2、菌產品其他理化指標檢測技術食用菌產品其他理化指標檢測技術灰份灰份總糖總糖VC檢測技術檢測技術粗蛋白粗蛋白雜質雜質 VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法 簡便/須脫色、干擾多（深色、其他還原性物質）二甲苯二氯靛酚比色法 深色熒光法：準確度高，較復雜2，4-二硝基苯肼法還原型VC的測定總VC的測定總VC=氧化型VC+還原型VC+二酮古樂糖酸少氧化+還原+二酮古樂糖酸操作復雜，結果易受影響氧化型+還原型 VCVC檢測技術檢測技術 2,6二氯靛酚滴定法1、原理 VC的提取: 用草酸/偏磷酸（不常用,需要在合適的PH下進行提取)將樣品中的VC提取出來 用藍色的堿性染料標準溶液(2,6二氯靛酚標準

3、溶液),對提取液進行氧化還原滴定 根據消耗的染料的量可計算出樣品中還原型VC的含量 終點指示原理:染料被還原為無色,當到達滴定終點時,多余的染料在酸性介質中則表現為淺紅色,2,6二氯靛酚堿性 酸性藍色 紅色 VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法2、試劑（1）2,6二氯靛酚(2,6二氯靛酚吲哚酚鈉鹽)溶液 配制 碳酸氫鈉 熱蒸餾水溶解加2，6二氯靛酚溶解 冷卻后定容 過濾保存?zhèn)溆米厣康蜏氐味ǘ鹊臏y定：每次使用均要進行該操作 VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法2、試劑 1ml抗壞血酸標準溶液 10ml浸提劑 用2 ，6二氯靛酚溶液滴定 呈粉紅色15s不褪色取 10ml浸提劑做空

4、白試驗 （2%草酸OR2%偏磷酸） CV 滴定度 T(mg/ml) V1V2 T每毫升2，6二氯靛酚溶液相當于抗壞血酸的毫克數C抗壞血酸的濃度,mg/mlV吸取抗壞血酸的體積, mV1滴定抗壞血酸溶液所用 2，6二氯靛酚溶液的體積，mlV2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的體積，ml。 VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法2 2、試劑、試劑（2）抗壞血酸標準溶液）抗壞血酸標準溶液(1mg/ml) u稱取稱取 100mg(準確至準確至 0.1mg)抗壞血酸，溶于抗壞血酸，溶于浸提劑浸提劑中并稀至中并稀至100mlu現配現用現配現用u試劑發(fā)黃，則棄去不用試劑發(fā)黃，則棄去不用 VCVC檢測技術

5、檢測技術2,6二氯靛酚滴定法3、實驗步驟(VC的提取/滴定/空白滴定)取樣品浸提劑搗成勻漿稱取部分勻漿浸提劑定容到100ml 過濾濾液有顏色用白陶土脫色0.4g /g樣品 取濾液10ml 2,6二氯靛酚溶液滴定 自身為指示劑 淺紅色酸式滴定管空白實驗：浸提劑10ml VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法3、實驗步驟 (VV0)TA 維生素C(mg/100g)-100 WV滴定樣液時消耗染料溶液的體積，mlV0滴定空白時消耗染料溶液的體積，mlT2，6二氯靛酚染料滴定度，mg/mlA稀釋倍數 定容體積/吸取體積W樣品重量，g VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法4、注意事項 （1

6、）15秒鐘紅色不褪為終點 樣品中可能有其他雜質也能還原2，6-二氯靛酚，但一般雜質還原該染料的速度均較抗壞血酸慢（2） 必須做空白實驗 VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法4、注意事項（3）樣液制備時漿狀物泡沫可能太多，可加數滴丁醇或辛醇（4）整個操作過程要迅速防止被VC氧化 滴定過程一般不超過2min 滴定所用的染料應在1-4ml之間 （微量滴定管） 如果太多？太??？ 選擇合適的滴定管滴定開始時，染料溶液要迅速加入，直至紅色不立即消失,而后盡可能一滴一滴地加入 （先快后慢） VCVC檢測技術檢測技術2,6二氯靛酚滴定法4、注意事項（5）取樣后，應浸泡在已知量的2%草酸溶液中2%草酸有

7、抑制抗壞血酸氧化酶的作用（防止被氧化）1%草酸無此作用 VC檢測技術二甲苯二氯靛酚比色法1、原理 用定過量的 2,6二氯靛酚染料與試樣中的維生素C進行氧化還原反應，多余的染料在酸性環(huán)境中呈紅色 用二甲苯萃取后比色，在一定范圍內，吸光度與染料濃度呈線性相關，測剩余染料濃度，用差減法計算維生素 C含量。2、儀器與試劑基本同二氯靛酚比色法/偏磷酸浸提 VC檢測技術二甲苯二氯靛酚比色法2、實驗步驟（1）樣品處理 定容到100ml（同二氯靛酚比色法）（2）測定 30min內完成食用菌中雜質檢測5ml2%偏磷酸和5mlpH4.0的乙酸鈉緩沖液 6支試管/標準曲線（A500染料體積）5ml2%偏磷酸樣品浸出

8、液 樣品測定不同體積2,6二氯靛酚溶液 10ml二甲苯 用力搖動 取有機層測A500 用力搖動 +5mlpH4.0的乙酸鈉緩沖液+2ml染料溶液 用力搖動 VC檢測技術二甲苯二氯靛酚比色法2、實驗步驟（3）計算 (2V)TA 維生素 C(mg/100g)100 W食用菌中雜質檢測2所用 2,6二氯靛酚染料的體積，ml V查得 2,6二氯靛酚溶液的體積，mlA稀釋倍數T染料滴定度，mg/mlW樣品重量，g VC檢測技術 熒光法（氧化型VC+還原型VC）1、原理(1)偏磷酸提取樣品中的VC(2)活性炭氧化提取液中的VC 還原型VC氧化型VC 樣品中本來的氧化型VC 喹喔啉（具有熒光性）熒光強度與氧

9、化型VC的濃度在一定條件下成正比食用菌中雜質檢測+鄰苯二胺（OPDA） VC檢測技術熒光法（GB第一法）2、試劑 （1）100g/ml抗壞血酸標準溶液 先用偏磷酸-乙酸溶解并定容配成1mg/ml測pH食用菌中雜質檢測2.2 偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋2.2 偏磷酸-乙酸（2）活性C（活化）活性C1mol/L鹽酸 加熱回流1-2h VC檢測技術熒光法（GB第一法）2、試劑食用菌中雜質檢測過濾水洗烘箱中干燥洗到洗液中無Fe3+加入洗液藍色檢驗：2%亞鐵氯化鉀+1%鹽酸等量混合洗液中有Fe3+ VC檢測技術熒光法（GB第一法）3、實驗步驟（1）樣品提取食用菌中雜質檢測稱取樣品偏磷酸-乙酸溶液勻漿取適

10、量勻漿含有1-2mgvc調酸堿度百里酚藍指示劑顯紅色（2.8）偏磷酸-乙酸-硫酸定容到100ml過濾樣品濾液(2)用活性C氧化 VC檢測技術熒光法（GB第一法）3、實驗步驟（2）氧化處理食用菌中雜質檢測取樣品濾液100ml活性C過濾樣品氧化液振搖1mi取抗壞血酸標準溶液100ml標準氧化液取濾液最初幾ml舍去（3）制備試液（待測液）、標準液、空白液 VC檢測技術熒光法（GB第一法）3、實驗步驟食用菌中雜質檢測（3）制備試液（待測液）、標準液、空白液5ml 標準氧化液5ml 標準氧化液標準液標準空白液5ml 樣品氧化液5ml樣品氧化液試液（待測液）試液空白液5ml 硼酸-乙酸鈉加水定容到25ml

11、搖動15min5ml 50%乙酸鈉加水定容到100ml加水定容到25ml加水定容到100ml VC檢測技術熒光法（GB第一法）3、實驗步驟食用菌中雜質檢測（4）測熒光值標準液試液標準空白液試液空白液各2ml 5ml鄰苯二胺 避光放置35min 測熒光值（熒光分光光度計） 改為不同體積的標準液（0/0.5/1/1.5/2)標準曲線法樣品熒光值標樣熒光值樣品空白熒光值標樣空白熒光值 VC檢測技術熒光法（GB第一法）3、實驗步驟食用菌中雜質檢測（5）計算樣品中維生素C含量(mg/100g)=(IIb)c5D100(IsIsb)m100I樣品熒光值； Ib樣品空白溶液熒光值；Is標樣熒光值； Isb標

12、樣空白溶液熒光值c標樣質量濃度，0.1mg/mL（100g/ml）；m樣品的質量，g。 D樣品(測熒光值時)稀釋倍數；5-5ml標準氧化液100-樣品濾液100ml VC檢測技術熒光法（GB第一法）4、注意事項（1）盡快用偏磷酸-醋酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C （2）不易過濾可改為抽濾或離心后取上清液過濾（3）活性炭用量應適當與準確 （有吸附抗壞血酸的作用 ）（4）本法為外標法測定，也可通過標準曲線法測定（5）全部實驗應避光操作（6）空白液中硼酸的加入消除產品中丙酮酸的干擾食用菌中雜質檢測 VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）1、

13、原理 樣品中還原型樣品中還原型VC經活性炭氧化為氧化型經活性炭氧化為氧化型VC 原有的氧化型原有的氧化型VC 脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進行比色測定。脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進行比色測定。 食用菌中雜質檢測2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼紅色脎紅色脎 VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、實驗步驟（1）樣品提取）樣品提取 同前法同前法（2）氧化）氧化取25ml 樣品濾液2g活性C 振搖1min 過濾取濾液10ml 10ml2%硫脲溶液樣品氧化液 （3）呈色反應）呈色反應食用菌中雜質檢測最初濾液舍去4ml氧化液4ml氧化液4ml

14、氧化液空白平行實驗2，4二硝基苯肼373h防止防止VC繼續(xù)被氧化繼續(xù)被氧化促進脎的形成促進脎的形成氧化劑氧化劑+脫色劑脫色劑 VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、實驗步驟食用菌中雜質檢測冷卻空白液室溫樣品液冰水冰水冷卻2，4二硝基苯肼10-15min后 （4 4）85%85%硫酸處理硫酸處理本步已成脎，但顯色不穩(wěn)定本步已成脎，但顯色不穩(wěn)定用濃硫酸處理，轉變?yōu)橛脻饬蛩崽幚恚D變?yōu)殚偌t色的雙橘紅色的雙-2，4-二硝基苯二硝基苯每支+5ml 85%硫酸 邊加邊搖至少加1min室溫下放置30min VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝

15、基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、實驗步驟食用菌中雜質檢測 （5 5）比色測定）比色測定 測測A A500500 （6 6）繪制標準曲線）繪制標準曲線 50ml1mg/ml抗壞血酸標準溶液1g活性C 振搖1min 過濾取濾液10ml 5g硫脲 1%草酸定容到500ml （濃度為20g/ml ） 1%硫脲稀釋到不同濃度（1/2/4/6/10/12g/ml） 以下操作同樣品測定取4ml 2，4二硝基苯肼 373h 5ml 85%硫酸室溫下放置30min A500 標準曲線 VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、實驗步驟食用

16、菌中雜質檢測 （7 7）計算）計算X=（cV/m）F(100/1000)X樣品中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g；c由標準曲線查得或由回歸方程算得樣品溶液濃度，g/ml；m試樣質量，g；F樣品氧化處理時的稀釋倍數；V呈色反應所用試樣體積，ml。 VCVC檢測技術檢測技術2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）3、注意事項（1 1）試管自冰水中取出后，顏色會繼續(xù)變深，所試管自冰水中取出后，顏色會繼續(xù)變深，所以，加入硫酸后以，加入硫酸后30分鐘應準時比色。分鐘應準時比色。 （2）活性）活性C氧化劑氧化劑+脫色劑（深色樣品）脫色劑（深色樣品）無色或已脫色樣品無

17、色或已脫色樣品溴或溴或2，6二氯靛酚作氧化劑二氯靛酚作氧化劑（3）硫脲的加入）硫脲的加入防止防止VC繼續(xù)被氧化繼續(xù)被氧化 促進脎的形成促進脎的形成食用菌中雜質檢測食用菌中蛋白質檢測測定蛋白質的方法可分為兩大類測定蛋白質的方法可分為兩大類利用蛋白質的共性利用蛋白質的共性，即含氮量（，即含氮量（16%16%） 、肽鍵測定、肽鍵測定蛋白質含量蛋白質含量 ；利用蛋白質中特定利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團以氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質含量。及芳香基團等測定蛋白質含量。具體測定方法具體測定方法水楊酸比色法水楊酸比色法、紫外分光光度法、雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑法、紅

18、外光譜、紫外分光光度法、雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑法、紅外光譜蛋白質含量測定最常用的方法是凱氏定氮法蛋白質含量測定最常用的方法是凱氏定氮法食用菌中蛋白質檢測測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數系數（1/16%1/16%）而求出蛋白質的含量而求出蛋白質的含量為為粗蛋白含量（含有少部分含粗蛋白含量（含有少部分含N N非蛋白核酸、非蛋白核酸、生物堿等）生物堿等）18331833年年KieldahlKieldahl首先提出首先提出常量常量K氏定氏定N法法微量微量K氏定氏定N法法自動自動K氏定氏定N法法半微量半微量K氏定氏定N法、改良法等法、改良法等食用

19、菌中蛋白質檢測1 1、原理、原理樣品與濃硫酸和樣品與濃硫酸和催化劑催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解一同加熱消化，使蛋白質分解 碳和氫被氧化為碳和氫被氧化為COCO2 2和和H H2 2O O逸出逸出 有機氮轉化為氨，與硫酸結合成有機氮轉化為氨，與硫酸結合成硫酸銨硫酸銨常量常量K氏定氏定N法法硫酸銅作催化劑常量、微量、半微量硫酸銅+二氧化鈦改良 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2O 食用菌中蛋白質檢測1 1、原理、原理常量常量K氏定氏定N法法l加硫酸銅加硫酸銅催化劑催化劑指示消化終點指示消化終點：溶液為藍綠色（：溶液為藍綠色（硫酸銅

20、溶液顏色）硫酸銅溶液顏色），清澈透明，清澈透明l加氧化劑加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度蒸餾時堿性反應的指示劑蒸餾時堿性反應的指示劑（判斷加堿量是否足夠）（判斷加堿量是否足夠）C+CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO4 2CuSO4+2H20+SO2 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色而不成褐色蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色而不成褐色（氫氧化（氫氧化銅沉淀、銅沉淀、CUO沉淀、銅離子與氨的絡合物），沉淀、銅離子與氨的絡合物），此時需再增加氫氧化此時需再增加氫氧化鈉用量。鈉用量。食用菌中蛋白質檢測常量常量K氏定氏定

21、N法法 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2O 消化l一定是濃硫酸：一定是濃硫酸：濃硫酸具有脫水性濃硫酸具有脫水性使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮濃硫酸又具有氧化性濃硫酸又具有氧化性2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫H2SO42NH3 (NH4)2SO4l加硫酸鉀加硫酸鉀增溫劑，提高溶液沸點（增溫劑，提高溶液沸點（330400）濃硫酸酸性濃硫酸酸性食用菌中蛋白質檢測1 1、原理、原理用硼酸吸收氨用硼酸吸收

22、氨以標準以標準HClHCl溶液滴定。根據標準酸消耗量可以計算出溶液滴定。根據標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。蛋白質的含量。 也可以用過量的標準也可以用過量的標準H H2 2SOSO4 4或標準或標準HClHCl溶液吸收后再溶液吸收后再以標準以標準NaOHNaOH滴定過量的酸。滴定過量的酸。常量常量K氏定氏定N法法整個過程：消化、堿化、蒸餾、吸收、滴定整個過程：消化、堿化、蒸餾、吸收、滴定2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B407+H2S04+5H20 (NH4)2SO4+4H2BO2 加堿蒸餾，使氨蒸出加堿蒸餾，使氨蒸出(NH4)2SO4+2NaOH2NH3

23、+2H2O+Na2SO4食用菌中蛋白質檢測2 2、儀器與試劑、儀器與試劑（1）通風櫥 （2）消化裝置（3）蒸餾裝置（4）鹽（硫）酸標準溶液 配制、標定（5）奈氏試劑奈氏試劑Nessler試劑，試劑，K2（HgI4） 常量常量K氏定氏定N法法3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于溶于70 毫升水。加毫升水。加30毫毫升升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。時過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。溶解溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清

24、液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。食用菌中蛋白質檢測3 3、實驗步驟、實驗步驟（1）消化 常量常量K氏定氏定N法法5克樣品+10克結晶硫酸鉀+l克硫酸銅 +濃硫酸25毫升小火加熱保持和緩的沸騰使火力集中在凱氏瓶底部（以免濺附在壁上的蛋白質處于無硫酸存在的情況，使氮有損失。 ） 液體為藍藍綠色透明綠色透明繼續(xù)加熱微沸1h冷卻l樣品放入定氮瓶內時，樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上不要沾附頸上.(用水沖用水沖洗洗)l消化時如不呈透明溶消化時如不呈透明溶液，可放冷后，慢慢加液，可放冷后，慢慢加入入30%過氧化氫過氧化氫2-3ml，促使氧化。促使氧化。l消化時應

25、注意不時轉消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，動凱氏燒瓶， 利用冷凝酸液將附在利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下瓶壁上的固體殘渣洗下 促進其消化完全促進其消化完全食用菌中蛋白質檢測3 3、實驗步驟、實驗步驟（2）蒸餾、吸收常量常量K氏定氏定N法法B 25毫升硼酸吸收液 甲基紅溴甲酚綠混合指示劑 l 下端插入液面下 l40（可放在冷水浴中）A少量水、消化液、玻璃球C 80毫升50%氫氧化鈉溶液 D 加熱蒸餾 將全部氨蒸出:l估計時間1-2hl奈氏試劑檢查是否蒸完lPH試紙檢查冷凝管下端用水沖洗后繼續(xù)蒸餾1min后關閉熱源（防止倒吸） 檢驗檢驗NH4+離子，遇銨根離子，遇銨根離子析出黃色或紅棕色沉離

26、子析出黃色或紅棕色沉淀淀食用菌中蛋白質檢測3 3、實驗步驟、實驗步驟（3）滴定常量常量K氏定氏定N法法餾出液 標準鹽酸溶液滴定 甲基紅溴甲酚綠混合指示劑 藍色微紅色別忘記做空白實別忘記做空白實驗！驗！不稱樣不稱樣消化消化蒸餾蒸餾吸收吸收滴滴定定食用菌中蛋白質檢測3 3、實驗步驟、實驗步驟（4）計算常量常量K氏定氏定N法法 C(V1-V) X 0.014 總氮()= X 100 W C鹽酸標準溶液的摩爾濃度； V1樣液滴定消耗的鹽酸標準溶液的量(毫升)； V空白滴定消耗的鹽酸標準溶液的量(毫升)； W樣品重量(克)； 0.014氮的毫摩爾 粗蛋白質()=總氮() K K換算系數，食用菌產品等于4

27、.38 食用菌中蛋白質檢測4 4、注意事項、注意事項（1 1）樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上，萬一沾）樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。偏低。（2 2）消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷）消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入后，慢慢加入30%30%過氧化氫過氧化氫2-3ml2-3ml，促使氧化。，促使氧化。 （3 3）消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷）消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗

28、下，并促進其消化完全。化完全。常量常量K氏定氏定N法法食用菌中蛋白質檢測（4 4）蒸餾裝置不能漏氣）蒸餾裝置不能漏氣（5 5）各種試劑及裝置的作用及影響）各種試劑及裝置的作用及影響濃濃H H2 2SOSO4 4 脫水炭化脫水炭化( (生成生成CHN)CHN)、氧化、與、氧化、與NHNH3 3作用作用CuSOCuSO4 4 催化劑、指示劑（消化、蒸餾前加堿）催化劑、指示劑（消化、蒸餾前加堿）K K2 2SOSO4 4 提高沸點提高沸點有時加入硒粉、氧化汞有時加入硒粉、氧化汞催化劑（為了防止污染通常采用催化劑（為了防止污染通常采用硫酸銅）硫酸銅）50%NaOH50%NaOH的作用：釋放銨鹽中的的作

29、用：釋放銨鹽中的NHNH3 3 。常量常量K氏定氏定N法法食用菌中蛋白質檢測K K氏燒瓶和取樣量氏燒瓶和取樣量1g1g以上的樣品，以上的樣品，K K氏燒瓶最小氏燒瓶最小500ml 500ml （加熱均勻（加熱均勻 縮短消化時間）縮短消化時間）H H2 2SOSO4 4和和K K2 2SOSO4 4的添加量的添加量 ( (一般指導原則一般指導原則) ) 1g樣品樣品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 若取樣量較大，如干試樣若取樣量較大，如干試樣5 g 可按每克試樣可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。吸收液吸收液 標準標準H2SO4 溶液：用標準堿返滴定，甲醛溶液：

30、用標準堿返滴定，甲醛(基基)紅指示劑紅指示劑 硼酸硼酸 ：用：用HCl進行滴定，混合指示劑進行滴定，混合指示劑蒸餾蒸餾 常量法常量法直接蒸餾直接蒸餾 微量法微量法水蒸汽蒸餾水蒸汽蒸餾常量常量K氏定氏定N法法l不需要精確知道體積l不需要標定濃度l弱酸對酸堿滴定要求低食用菌中蛋白質檢測微量微量K氏定氏定N法法原理及適用范圍同前原理及適用范圍同前與常量法不同點與常量法不同點 樣品質量、試劑量變少樣品質量、試劑量變少 微量滴定管微量滴定管 微量凱氏定氮微量凱氏定氮裝置（水蒸氣蒸餾）裝置（水蒸氣蒸餾）實驗操作（1）消化 最后加水定容到100ml ,其他與常量法一樣（2）蒸餾 食用菌中蛋白質檢測微量微量K

31、氏定氏定N法法（1）按圖安裝好按圖安裝好微量定微量定氮蒸餾裝置氮蒸餾裝置（2）裝水2/3甲基橙、硫酸數ml（保持酸性）（3）10ml 4%硼酸硼酸2滴混合指示劑滴混合指示劑（4）10.00ml樣品消化稀釋液（5）少量水沖洗（6）10ml10%氫氧化鈉（7）少量蒸餾 水沖洗， （8）加熱蒸餾吸收液變?yōu)榫G色計時蒸餾10min 冷凝管提離液面繼續(xù)蒸餾1min（9）滴定食用菌中蛋白質檢測自動自動K氏定氏定N法法1、原理及適用范圍同前、原理及適用范圍同前2、特點：、特點：（1）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一

32、次可同時消化）快速：一次可同時消化8個樣個樣品，品，30分鐘可消化完畢。分鐘可消化完畢。（3）自動：）自動：自動加堿蒸餾自動加堿蒸餾，自動吸自動吸收和滴定收和滴定，自動數字顯示裝置?？?，自動數字顯示裝置?？捎嬎阌嬎憧偟俜趾坎⒂涗浛偟俜趾坎⒂涗?，數分鐘，數分鐘完成完成1個樣。個樣。食用菌中蛋白質檢測1 1、原理、原理( (標準曲線法標準曲線法) )樣品中的樣品中的propro經經H H2 2SOSO4 4消化轉化為銨鹽溶液消化轉化為銨鹽溶液在一定的酸度和溫度下與水楊酸鈉和次氯酸鈉在一定的酸度和溫度下與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物作用生成有顏色的化合物在波長在波長660nm660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。算蛋白質含量。2 2、試劑、試劑水楊酸比色法水楊酸比色法食用菌中蛋白質檢測（1）氮標準溶