HPLC原理和應(yīng)用

1、 高效液相色譜（高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是）是20世紀(jì)世紀(jì)60年代末年代末發(fā)展起來(lái)的一種新型微量分離分析技術(shù)。發(fā)展起來(lái)的一種新型微量分離分析技術(shù)。 高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏檢測(cè)器，因而具備速泵、高效固定相和高靈敏檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)

2、備和檢測(cè)手段主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1 1經(jīng)典經(jīng)典LCLC：僅做為一種分離手段：僅做為一種分離手段 常壓輸送流動(dòng)相，分析周期長(zhǎng)常壓輸送流動(dòng)相，分析周期長(zhǎng) 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑13cm13cm，固定相粒徑，固定相粒徑100m 100m 且不均勻且不均勻 柱效低（柱效低（HH，nn） 無(wú)法在線檢測(cè)無(wú)法在線檢測(cè)2HPLC：分離和分析：分離和分析 高壓（高壓（1.47-2.941014 Pa）輸送流動(dòng)相，分析）輸送流動(dòng)相，分析時(shí)間大大縮短時(shí)間大大縮短 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑28mm，固定相粒徑，固定相粒徑20 m，多采用干法填充；，多采用干法填充； 填料顆粒填料顆粒 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙

3、醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二二氧六環(huán)氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化二硫化碳碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用）盡量使用高純度試劑高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用發(fā)生作用而使柱效下降或損壞而使柱效下降或損壞柱子，如使固定液溶解流失；

4、酸性溶劑破壞氧化鋁固定柱子，如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。淀并在柱中沉積。（4）使用二元體系流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)該注意）使用二元體系流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)該注意兩種溶劑能否兩種溶劑能否互溶互溶。（5）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)器的要求檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。溶劑溶劑紫外截止波長(zhǎng)紫外截止波長(zhǎng)/nm正己烷正己烷190二硫化碳二硫化碳380四氯化碳四氯化碳265苯苯210氯仿氯仿245二氯甲烷二氯

5、甲烷233四氫呋喃四氫呋喃212丙酮丙酮330乙腈乙腈190甲醇甲醇205水水187流動(dòng)相在使用前應(yīng)該過(guò)濾、脫氣！流動(dòng)相在使用前應(yīng)該過(guò)濾、脫氣！除了在分析前利用真空或超聲波脫氣之外，除了在分析前利用真空或超聲波脫氣之外，可以使用在線脫氣?？梢允褂迷诰€脫氣。三、進(jìn)樣三、進(jìn)樣定量環(huán)規(guī)格：定量環(huán)規(guī)格：2ul、5ul、10ul、20ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul、2000ul、5000ul。蛋白的上樣量取決于檢測(cè)器的靈敏度蛋白的上樣量取決于檢測(cè)器的靈敏度Effect of Sample Load on Protein Peak Shape and Resolution

6、手柄位進(jìn)樣手柄位進(jìn)樣( (LoadLoad) )位置時(shí)，樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔注位置時(shí)，樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔注射進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充滿(mǎn)后，多余樣品從放空孔排出；射進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充滿(mǎn)后，多余樣品從放空孔排出；將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣( (InjectInject) )位置時(shí)，閥與液相流路接通，位置時(shí)，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán)，推動(dòng)樣品進(jìn)入液相分析柱由泵輸送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán)，推動(dòng)樣品進(jìn)入液相分析柱進(jìn)行分析。進(jìn)行分析。Load Inject手柄處于手柄處于LoadLoad和和InjectInject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中流路

7、中壓力驟增壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱頭上，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途不能停留在中途。在液相色譜系統(tǒng)開(kāi)始工作前，可以用注射器連接恒流泵在液相色譜系統(tǒng)開(kāi)始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽出流動(dòng)相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈。的排空閥，抽出流動(dòng)相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈。在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。 避免氣泡的產(chǎn)生避免氣泡的產(chǎn)生：HPLC有等度洗脫有等度洗脫(isocratic elution)和梯度洗脫和梯度洗脫(gradient elution)兩種方

8、式。兩種方式。等度洗脫等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定組成保持恒定，適合，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。四、洗脫四、洗脫等度洗脫缺點(diǎn)等度洗脫缺點(diǎn)梯度洗脫梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常

9、常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫洗脫曲線曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變?cè)谶M(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：要注意溶劑的要注意溶劑的互溶性互溶性，不相

10、混溶的溶劑不能用作梯度洗，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。梯度洗脫所用的溶劑梯度洗脫所用的溶劑純度純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后

11、會(huì)被強(qiáng)溶劑洗峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡?；旌先軇┑幕旌先軇┑恼扯日扯瘸ｋS組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)出現(xiàn)壓力的變化壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸

12、液泵或色譜柱能承受的最大壓力。能承受的最大壓力。流速流速選擇合適的流速對(duì)于維持一定柱壓，保證層析峰的峰形以選擇合適的流速對(duì)于維持一定柱壓，保證層析峰的峰形以及洗脫時(shí)間都有一定影響，流速控制可參考下表及洗脫時(shí)間都有一定影響，流速控制可參考下表 210004.6d =對(duì)于內(nèi)徑不同的層對(duì)于內(nèi)徑不同的層析柱，其合適的流析柱，其合適的流速計(jì)算公式速計(jì)算公式在對(duì)未知樣進(jìn)行洗脫時(shí)，可以選擇如下方式以了解樣品的在對(duì)未知樣進(jìn)行洗脫時(shí)，可以選擇如下方式以了解樣品的疏水性：疏水性：在在0B的流動(dòng)相中，疏水性強(qiáng)的的流動(dòng)相中，疏水性強(qiáng)的C18烷基鏈容易貼在固定烷基鏈容易貼在固定相載體顆粒的表面，從而降低與樣品的結(jié)合。相

13、載體顆粒的表面，從而降低與樣品的結(jié)合。因此一般開(kāi)始時(shí)選用因此一般開(kāi)始時(shí)選用2-5B的流動(dòng)相洗脫。的流動(dòng)相洗脫。洗脫條件的優(yōu)化洗脫條件的優(yōu)化洗脫梯度洗脫梯度洗脫時(shí)間洗脫時(shí)間柱平衡柱平衡洗脫時(shí)間依照柱長(zhǎng)、流動(dòng)相性質(zhì)的不同而變化。洗脫時(shí)間依照柱長(zhǎng)、流動(dòng)相性質(zhì)的不同而變化。每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)恢復(fù)到初始狀態(tài)到初始狀態(tài)。需讓。需讓1030倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書(shū)，注意適用范圍，使用前仔細(xì)

14、閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書(shū)，注意適用范圍，如如pHpH值范圍、流動(dòng)相類(lèi)型等。值范圍、流動(dòng)相類(lèi)型等。2、選擇使用適宜的、選擇使用適宜的流動(dòng)相流動(dòng)相（尤其是（尤其是pH），以避免固定相），以避免固定相被破壞。被破壞。3、應(yīng)、應(yīng)逐漸改變逐漸改變?nèi)軇┑慕M成溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?、當(dāng)采用、當(dāng)采用鹽緩沖溶液鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與

15、之接觸。會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。5、避免將、避免將基質(zhì)復(fù)雜基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一一保護(hù)柱保護(hù)柱。6、一般說(shuō)來(lái)色譜柱、一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。速降低柱效。7、保存色譜柱保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干

16、燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。8、色譜柱使用過(guò)程中，避免柱壓過(guò)高。如果、色譜柱使用過(guò)程中，避免柱壓過(guò)高。如果壓力升高壓力升高，一，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕龇N可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污進(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染。染。 9、不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱； 使用過(guò)程中注意輕拿輕放。使用過(guò)程中注意輕拿輕放。典型窗口元素（運(yùn)行樣品）典型窗口元素（運(yùn)行樣品）第六節(jié)第六節(jié) 高效液相色譜的應(yīng)用高效液相色譜的應(yīng)用環(huán)境保護(hù)環(huán)境保護(hù)農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)醫(yī)藥醫(yī)藥生化研究生化研究食品質(zhì)量食品質(zhì)量http:/www.forumsci.co.il/HPLC/topics.htmlTopics in Liquid Chromatographyhttp:/ of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications思考題思考題1、高效液相色譜與常規(guī)液相色譜相比為什么有很高的分、高效液相色譜與常規(guī)液相色譜相比為什么