抗核抗體檢測的質(zhì)量要求及結(jié)果的合理判讀(李曉軍)(2)

1、抗核抗體檢測的質(zhì)量要求及結(jié)果的合理判讀李曉軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所自身免疫性疾病自身免疫病(Autoimmune diseases,AID)主要病理基礎(chǔ)：-血清中存在有一種或多種針對自身組織成份的抗體標(biāo)志血清中存在有一種或多種針對自身組織成份的抗體標(biāo)志物及自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞致病機制：-自身抗體和自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞在自身抗體和自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞在AID的發(fā)病過程中起重的發(fā)病過程中起重要作用1)體液免疫：由自身抗體介導(dǎo)、過敏反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷2)細(xì)胞免疫：自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用3)二者共同參與：抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）4)自身免疫病的系統(tǒng)受累AID的類型：1

2、）器官特異性AID2）系統(tǒng)性AID（非器官特異性）AID主要特征：1）相關(guān)的臨床癥狀）相關(guān)的臨床癥狀2）ESR增高增高, 血清Ig, 自身抗體、CIC陽性陽性, 血清補體(C3、C4)活性降低3）有病變且病變處存在有與自）有病變且病變處存在有與自身抗原分布相關(guān)的免疫活性細(xì)胞或抗體4）將相關(guān)抗原給動物注射時能）將相關(guān)抗原給動物注射時能重復(fù)出類似人的疾病，當(dāng)被動輸入淋巴細(xì) 胞或抗體時可將疾病從患病動物轉(zhuǎn)移給正常動物自身免疫病的“病譜”器官特異性非器官特異性橋本甲狀腺炎擴張性心肌炎自身免疫性溶血性貧血系統(tǒng)性紅斑狼瘡原發(fā)性粘液水腫 惡性貧血特發(fā)性血小板減少性紫癜 干燥綜合征甲狀腺機能亢進 自身免疫性胃

3、炎特發(fā)性粒細(xì)胞減少癥類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Addisino病病1型糖尿病型糖尿病重癥肌無力多發(fā)性硬化癥脫髓鞘疾病尋常型天皰瘡類天皰瘡自身免疫性肝炎原發(fā)性膽汁性肝硬化原發(fā)性硬化性膽管炎潰瘍性結(jié)腸炎克羅恩病自身免疫性腎小球腎炎肺腎出血綜合征絕經(jīng)過早（少數(shù)病例）男性不育（少數(shù)病例）交感性眼炎晶狀體源性葡萄膜炎硬皮病多發(fā)性肌炎/皮肌炎混合性結(jié)締組織病系統(tǒng)性血管炎抗磷脂綜合征藥物性狼瘡自身免疫病共同特征1. 病因不明2. 女性居多，發(fā)病率隨年齡增加而增加3. 有遺傳傾向4. 患者血清中有多種自身抗體或自身反應(yīng)性致敏淋巴細(xì)胞5. 疾病有重疊現(xiàn)象，即一個病人可同時患一種以上自身免疫病6. 病程一般較長，多遷延為慢性7

4、. 病損局部可發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤8. 免疫抑制劑治療可取得一定療效自身免疫病主要實驗檢查自身抗體免疫球蛋白補體淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子自身抗體與臨床疾病的關(guān)系天然自身抗體：維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定靶抗原：肌動蛋白、肌球蛋白、角蛋白、DNA、膠原、Ig、細(xì)胞因子等，多為IgM型、低滴度；病理性自身抗體：在免疫風(fēng)濕病的發(fā)病過程中起重要作用1）診斷、鑒別診斷：抗）診斷、鑒別診斷：抗dsDNA、抗、抗Sm抗體與抗體與SLE；抗；抗CCP與與RA；AoAb與、女性不育、流產(chǎn)有與、女性不育、流產(chǎn)有關(guān)者2）疾病監(jiān)測、預(yù)后判定：抗）疾病監(jiān)測、預(yù)后判定：抗dsDNA為為SLE疾病疾病活動標(biāo)志自身抗體的特性

5、自身免疫性疾病的重要標(biāo)志高滴度存在于自身免疫性疾病患者與疾病的活動性相關(guān)參與免疫病理性損傷常檢測的自身抗體抗核抗體（ANA）抗可提取性核抗原抗體（A-ENA）抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）類風(fēng)濕因子（RF）抗角蛋白抗體（AKA）抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）抗核抗體（ANA）抗核抗體:針對真核細(xì)胞（HEp-2、肝細(xì)胞）各種核成分靶抗原的自身抗體的總稱?？购丝贵w（ANA）抗DNA抗體（anti-dsDNA，anti-ssDNA ）抗組蛋白抗體（histones: H1 , H2A , H2B , H3 , H4 , H2A-H2B）抗ENA（抗: Sm , nRNP , SSA/Ro , S

6、SB/La,rRNP , Scl-70 , Jo-1 , PCNA , .）ANAs抗非組蛋白抗體抗著絲點抗體（ anti-CENP -A , B , C ，D，F(xiàn)，G）抗核仁抗體抗其他細(xì)胞成分抗體（高爾基體，中心體，紡錘體，線粒體，溶酶體，肌動蛋白，Vimentin，細(xì)胞角蛋白，Lamin)1.2.3.4.抗核抗體譜的分類和命名以首先檢出該抗體的患者名字命名，如抗Sm、抗Sa 抗體等；以相關(guān)疾病命名，如抗Scl-70、抗SS-A、抗SS-B 抗體等；以抗原的部位命名，如抗核仁抗體、抗線粒體抗體、抗核膜抗體、抗細(xì)胞漿抗體等；以抗原的化學(xué)名稱分類命名，如抗DNA、抗RNP、抗組蛋白抗體,抗核小體

7、抗體等。常規(guī)臨床診斷ANA種類:數(shù)十種新自身抗體和檢測方法:陸續(xù)被引進臨床實驗室為臨床醫(yī)生提供更多的選擇和診斷指標(biāo)另一方面也帶來一定的困惑?如何根據(jù)患者病情挑選具有診斷價值的最佳自身抗體組合?如何選擇合理的檢測方法，并對結(jié)果作出正確的判斷?將為患者得到及時準(zhǔn)確的診斷和治療發(fā)揮至關(guān)重要的作用!免疫檢驗工作者的目的:廣泛向臨床醫(yī)生宣傳有關(guān)ANA項目及其檢測技術(shù)的價值及其限制，宣傳ANA選擇的適應(yīng)征及有效性，從而對檢測結(jié)果作出科學(xué)合理的判讀。保證檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性讓臨床醫(yī)生了解各種測定方法的特性包括方法的精確度、靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值、似然比等，關(guān)系到醫(yī)生如何準(zhǔn)確地選擇這些檢測

8、項目服務(wù)于患者，并合理地利用資源。敏感性（sensitivity）特異性（specificity）敏感性: 某檢驗項目對某病具有鑒別、確認(rèn)的能力患者陽性結(jié)果的百分比特異性: 某檢驗項目排除無某病的能力非患者陰性結(jié)果的百分比敏感性和特異性取決于所選用的cut-off值某法敏感性越高，特異性就越低，反之亦然應(yīng)優(yōu)選能獲得最佳敏感性和特異性組合的cut-off值敏感性和特異性并不能告訴醫(yī)生陽性結(jié)果的個體是否患某種疾病，陰性結(jié)果的個體是否不患某種疾病而臨床醫(yī)生關(guān)心的是，ANA陽性者中有多少是CTD患者；ANA陰性者中有多少不是CTD患者。PPV和NPV即回答這一問題陽性預(yù)測值（PPV）陰性預(yù)測值（NPV

9、）PPV：試驗結(jié)果陽性者中真正患病的概率NPV：試驗結(jié)果陰性者中未患病的概率PPV和NPV是臨床試驗中對試驗有用性的正確評價指標(biāo)PPV和NPV受人群患病率的影響：患病率： PPV ，NPV理想的ANA試驗：高PPV：大部分陽性結(jié)果者是CTD患者高NPV：大部分陰性結(jié)果者不患CTDANA檢測的選擇原則臨床醫(yī)生選擇ANA檢測的目的：1）在有典型癥狀患者中作出CTD的診斷2）在癥狀不確定患者中排除CTD的診斷3）明確CTD的類別4）判斷病情活動度ANA檢測的選擇原則檢測的選擇原則通常原則:）首先采用以HEp-2細(xì)胞為基質(zhì)片的IFA作為篩查實驗，以有效地排除CTD的存在）ANA陽性 進一步檢查抗ds-

10、DNA或抗ENA抗體，以期對CTD作出特異性地診斷。）不主張單獨用抗ENA抗體作為篩查實驗ANA免疫學(xué)測定方法免疫學(xué)測定方法瓊脂雙向擴散或?qū)α髅庖唠娪?抗ds-DNA，抗Sm，抗U1RNPFarr試驗：抗ds-DNA間接免疫熒光技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)” (篩查)-抗核抗體(ANA)、抗ds-DNA抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)、ANCA等酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):自身抗體確認(rèn)免疫印跡免疫斑點技術(shù):自身抗體確認(rèn)-ENA多肽抗體譜、AMA(M2/M4/M9)、抗LKM-1、抗LC-1、抗SLA/LP等微陣列免疫芯片技術(shù)懸浮芯片技術(shù)IFAANAIFA篩查篩查ANA有效的有效的“

11、金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”基質(zhì)片抗原：鼠肝勻漿組織敏感性差，不能測出抗SSAHep-2細(xì)胞細(xì)胞陽性檢出率高Ro60 cDNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞（細(xì)胞（Hep-2000TM）可顯）可顯著提高檢測抗SSA/Ro抗體的敏感性1)IFAANA如何鑒別假陽性現(xiàn)象(滴度, 核型)?血清稀釋度：1:40：健康人：健康人ANA高達高達30%；1:160： 則僅5%高滴度的ANA陽性結(jié)果方有診斷意義2) 核型:3) A-ENA:健康人健康人A-ENA常為陰性常為陰性Mariz.Arth Rheumatol, 2011, 63: 191ANA-IFA核型有助核型有助于區(qū)別正常人ANA+和和ARDANA+?密而細(xì)顆粒型抗核

12、膜抗體(抗板層素抗體)熒光模式:在核膜區(qū)呈現(xiàn)線狀熒光, 中心區(qū)域熒光強度弱(Hep-2), 而肝細(xì)胞片:中心區(qū)域發(fā)暗,無熒光, 此點可與核均質(zhì)熒光相區(qū)別.靶抗原:包括60kD, 68kD和74kD 3種蛋白組分,與中間絲相關(guān),以網(wǎng)狀形式包被在核內(nèi)膜的內(nèi)部.相關(guān)疾病: 慢性活動性自身免疫性肝炎的活動期.ANA(均質(zhì)型)熒光模式:Hep-2細(xì)胞: 間期細(xì)胞核陽性,呈均勻的熒光; 核仁與核漿一樣呈強度相同的均質(zhì)熒光; 分裂期染色體陽性(增強), 亦呈均勻的熒光.肝細(xì)胞片:肝細(xì)胞核陽性,呈均勻的熒光, 與Hep-2細(xì)胞的熒光強度一致.主要相關(guān)自身抗體:抗ds-DNA, 核小體和組蛋白抗體等.EUROI

13、MMUN粗顆粒型抗RNP/Sm抗體熒光模式: Hep-2細(xì)胞:間期時,整個細(xì)胞核呈現(xiàn)粗顆粒,但有時也出現(xiàn)中等到細(xì)的顆粒熒光,核仁為陰性;在分裂期細(xì)胞中,濃縮的染色體部位為陰性,而外周區(qū)幾乎為均質(zhì)型、光滑的熒光.靈長類肝組織切片:細(xì)胞核亦呈現(xiàn)顆粒型熒光,核仁為陰性,熒光強度與 Hep-2細(xì)胞相同.細(xì)顆粒型抗SS-A/SS-B抗體熒光模式: Hep-2細(xì)胞:間期細(xì)胞核呈現(xiàn)細(xì)顆粒型熒光,核仁有部分不發(fā)熒光。分裂期細(xì)胞在染色體以外顯示顆粒熒光,而染色體本身則不發(fā)熒光. 靈長類肝組織切片: 肝細(xì)胞核及部分核仁可見細(xì)顆粒熒光,細(xì)胞漿不發(fā)熒光. 在某些細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）中的熒光反應(yīng)較強EUROIM

14、MUNANA常見核型與疾病關(guān)系常見核型與疾病關(guān)系Diagnostic Pathology 2009, 4:1ANA臨床診斷臨床診斷CTD特性特性Diagnostic Pathology 2009, 4:1Arth Rheumat,2002,47, pp 434444ANA(+)臨床診斷意義臨床診斷意義對疾病診斷非常重要SLE、系統(tǒng)性硬化病對疾病診斷有一定作用干燥綜合征、多發(fā)性肌炎-皮肌炎對監(jiān)測預(yù)后非常重要幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分藥物引起的狼瘡、混合性結(jié)締組織病對疾病診斷、監(jiān)測預(yù)后沒有作用類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、甲狀腺疾病、傳染病、特發(fā)性血小板減少性紫癜纖維組織

15、肌痛IFA法檢測法檢測ANA時應(yīng)注意的問題時應(yīng)注意的問題ANA滴度和熒光圖譜不能作為判斷抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)滴度和熒光圖譜不能作為判斷抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果陽性時應(yīng)進一步作特異性抗核抗體項目的檢查IFA限制限制:*ANA(-)， 抗ds-DNA(+)， 抗ENA(+) 技術(shù)誤差SLE特殊類型特殊類型*某些某些ANA(抗抗SSA/Ro、抗、抗SSB/La)用用IFA難以測出難以測出*Jo-1抗原屬于胞漿抗原，抗原屬于胞漿抗原，IFA檢測檢測ANA陰性時不能排陰性時不能排除抗Jo-1的可能IFA法檢測法檢測ANA時應(yīng)注意的問題時應(yīng)注意的問題如果臨床高度懷疑CTD，應(yīng)同時做ANA和抗ENA抗體，即使

16、ANA(-) ，也要進行抗ENA抗體的檢測，否則會漏檢一些ANA如抗SSA/Ro、SSB/La或抗Jo-1抗體。IFA法檢測法檢測ANA時應(yīng)注意的問題時應(yīng)注意的問題由于目前國內(nèi)缺乏合適的質(zhì)控品，檢測結(jié)果在實驗室間很難做到標(biāo)準(zhǔn)化。每個實驗室必須規(guī)范化各自的操作規(guī)程，確立各自的cut-off值，使判斷標(biāo)準(zhǔn)兼顧到診斷敏感性和診斷特異性的平衡。應(yīng)該參加當(dāng)?shù)鼗驀业氖议g質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）計劃。目前，國際上已有抗核抗體的標(biāo)準(zhǔn)參考品結(jié)果解釋應(yīng)密切結(jié)合其他臨床指標(biāo)ANA室間結(jié)果很難具備可比性室間結(jié)果很難具備可比性15個國際個國際Lab同時用同時用HEp-

17、2-IFA進行進行ANA的檢的檢測，所獲得的平均變異系數(shù)（CV）值如下：1:40 1:80室內(nèi)CV（%） 16.5 13.1室間CV（%） 50.7 44.31:16012.237.91:32012.836.0每個實驗室應(yīng)根據(jù)各自情況，建立本室的cut-off值，以確保實驗結(jié)果的精確性和可比性值，以確保實驗結(jié)果的精確性和可比性部分自身抗體的國際參考品參考品WHO Wo80WHO1064特異性dsDNA 100 IU/ampoule均質(zhì)型ANA 100 IU/ampouleMRC 參考品A 均質(zhì)型ANA 100 IU/ampouleWHO1063WHO1061CDC參考品參考品nRNPIgM A

18、NA 100 IU/ampouledsDNA、La、U1-RNP、Sm、Ro、中心粒、中心粒、Scl70、Jo-1抗ds-DNA檢測抗ds-DNA與SLE及狼瘡性腎炎的發(fā)生及其活動程度密切相關(guān)。檢測常用短膜蟲IFA（CLIF）、Farr試驗和ELISA技術(shù)。技術(shù)。Farr試驗是經(jīng)典的特異性檢測方法，但可測出試驗是經(jīng)典的特異性檢測方法，但可測出高親和力的IgM類抗ds-DNA。目前臨床推薦使用的是測IgG類抗ds-DNA的ELISA和和CLIF單鏈DNA,變性的DNA (嘌呤和嘧啶堿基)雙鏈DNA,天然DNA(氧核糖核酸骨架)相關(guān)疾病:風(fēng)濕病: ssDNA: SLE: 80.8%; Sjgren

19、s綜合征: 40.0%;硬皮病: 44.0%; RA: 12.3% (歐蒙)健康獻血員: 6.8% (歐蒙)風(fēng)濕病: dsDNA: SLE: 30% - 90%; 歐蒙 (51.7% )抗dsDNA抗體ANA(均質(zhì)型均質(zhì)型)組蛋白抗體：抗原:組蛋白H1, H2A, H2B, H3, H4(主要的靶抗原為H1和H2B); 功能: 核小體的形成相關(guān)疾病: 藥物誘導(dǎo)性 LE:100% (抗組蛋白抗體是該病唯一的標(biāo)志性抗體); SLE:40% - 80%、歐蒙(56.4%); 在其他風(fēng)濕病中很少見抗核小體抗體:抗原:組蛋白和DNA形成的復(fù)合物; 功能:染色體的功能亞單位。相關(guān)疾病: SLE: 58%

20、(歐蒙研究)歐蒙第二代: 對SLE的特異性為100%EUROIMMUN使用注意事項（1）不同組織來源（哺乳類或非哺乳類）的DNA做固相抗原，會有不同的結(jié)果（2）某些試驗可測出不同Ig類別的抗ds-DNA。如Farr試驗，或用多克隆抗人Ig抗體建立的ELISA或CLIF可檢測出IgM類抗ds-DNA。該類抗ds-DNA無診斷SLE的特異性。因此應(yīng)該采用檢測IgG類抗ds-DNA的ELISA或CLIF使用注意事項（3）高親和力抗ds-DNA對SLE特別是狼瘡性腎炎有特異性診斷價值，低親和力抗體則無。但ELISA往往能測出低親和力的抗ds-DNA，因此若ELISA結(jié)果陽性，必須用CLIF或Farr試

21、驗予以確認(rèn)。（4）CRP和ssDNA在Farr試驗、脂蛋白-IgG復(fù)合物在CLIF中可引起假陽性結(jié)果（5）嚴(yán)格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)量控制以確保檢測結(jié)果在實驗室間的可比性，實驗室應(yīng)該參加室間質(zhì)量控制（EQA）計劃抗可提取性核抗原（ENA）抗體譜的檢測 抗Sm抗體：SLE標(biāo)記性抗體（20%30%） 抗nRNP抗體：MCTD 95%100%（高滴度） 抗SSA抗體：PSS 60%75%，其它CTD 抗SSB抗體： PSS 10%40%，其它CTD 抗Scl-70抗體：SSc 25%75%, 標(biāo)記性抗體 抗Jo-1抗體：PM/DM 25%，標(biāo)記性抗體 抗組蛋白抗體： SLE特異性抗體（50%70%）抗ENA抗體

22、檢測方法雙向免疫擴散（ID）對流免疫電泳（CIE）免疫印跡法（Western-blot）免疫斑點ELISA酶免疫斑點法DID和和CIEP抗原與抗體在瓊脂(或瓊脂糖)凝膠中擴散或電場泳動中相遇形成沉淀線，通過對沉淀線的鑒別和用陽性血清作對照來進行判斷。經(jīng)典的檢測ENA抗體的方法CIEP的敏感性和特異性DID某些帶負(fù)電荷較少的抗原如Scl-70，在CIEP中的移動方向會與抗體一致而不形成沉淀線優(yōu)點：操作便利，特異性高，缺點：果判斷帶有一定的主觀性，需要經(jīng)驗，耗時長，不易獲得陽性標(biāo)準(zhǔn)血清酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作快速簡便，自動化程度高，定性和定量分析關(guān)鍵是獲取純化的特異抗原。重組抗原由于純度

23、的提高，也大大提高了檢測的特異性存在的問題：）重組抗原中可能混有大腸桿菌抗原，患者體內(nèi)的抗菌體蛋白抗體在試驗中可能造成假陽性反應(yīng)）重組抗原缺乏翻譯后折疊修飾過程，不能形成天然二級、三級結(jié)構(gòu)，可能丟失某些空間構(gòu)像的表位，導(dǎo)致實驗的假陰性反應(yīng)。采用真核系統(tǒng)表達重組抗原有助于解決這類問題。免疫印跡技術(shù)（IB）特異性和敏感性比DID、CIEP高，能在一次檢測中，同時完成對多種特異性（抗Sm、抗U1RNP、抗SSA、抗SSB、抗Scl-70、抗J0-1及抗核糖體抗體等）的識別和過篩因為抗原經(jīng)SDS-PAGE后發(fā)生變性，該法檢測的是抗線型抗原表位的抗體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印效果不佳，本底染色深SSA抗原轉(zhuǎn)印效果差，加

24、上15%的抗SSA抗體僅識別立體構(gòu)象的抗原表位，檢測抗SSA的敏感性要低于CIEP和ELISA；也不能測出某些抗Scl-70抗體免疫斑點技術(shù)（IB）IB繞過凝膠電泳，直接將純化的自身抗原包被在NC膜上由于抗原位置固定，結(jié)果判斷比WB簡單、可靠包被抗原純度高，膜條上沒有多余蛋白，顯色后非特異背景比WB要弱Jo-1 Centro液態(tài)芯片技術(shù)目前，國際上有BMD、BioRad Diagnostics、INOVA Diagnostics 、ZEUS Scientific 基于液芯平臺ANA檢測產(chǎn)品國內(nèi)尚未常規(guī)開展SSASSBRNPScl-70Smmere B DNAChromatin迄今為止還沒有一種檢測抗ENA既高特異又高敏感的方法。歐洲Consensus Workshops曾推薦采用兩種或兩種以上的方法檢測抗ENA抗體，由于費用昂貴，目前難以廣泛采納。某些實驗室采用ELISA-CIEP聯(lián)合應(yīng)用檢測技術(shù)來解決ELISA低親和力的問題，例如，先用簡便快速的ELISA篩查抗ENA抗體，陽性標(biāo)本再用CIEP予以確認(rèn)，但常規(guī)實驗室也難以接受ELISADIDCIEPHAANA測定方法比較測定方法比較方法IFANAWesternblot優(yōu)點經(jīng)濟、易操作、高靈敏度和特異性自動化、可定量、高靈敏