纖維素分解菌

1、課題重難點：課題重難點： 從土壤中分離分解纖維素的微生物從土壤中分離分解纖維素的微生物一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識纖維素酶纖維素酶C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶纖維素纖維素纖維二糖纖維二糖葡萄糖葡萄糖練一練：練一練：1.1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C. 纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖取二支取二支20m

2、L20mL的試管的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質(zhì)量為，物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1mL1mL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結(jié)果：結(jié)果：乙試管的濾紙條消失乙試管的濾紙條消失1 1、篩選纖維素分解菌的方法、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過該方法可以通過_反應(yīng)直接

3、篩選。反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法剛果紅染色法顏色顏色2 2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成_，當纖維素被，當纖維素被_分解后，分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_為中心的為中心的_，可以通過，可以通過_ _ 來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素酶纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈是否產(chǎn)生透明圈是否產(chǎn)生透明圈（二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是菌，下列說法錯誤的是A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)

4、合物剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌選出了纖維素分解菌( (三三) )、實驗設(shè)計、實驗設(shè)計土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯度梯度稀釋稀釋將樣品涂將樣品涂布到鑒別布到鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么什么樣的樣的環(huán)境環(huán)境取樣取樣? 培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的特點特點? ?挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的

5、特點? ?如何鑒別如何鑒別? ? 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。 培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉纖維素粉 5g碳源碳源NaNO3 1g氮源、無機鹽氮源、無機鹽KCl 0

6、.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g無機鹽無機鹽酵母膏酵母膏 0.5g生長因子、碳源、氮源生長因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生長因子氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至溶解后，蒸餾水定容至1000mL水水提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為有選擇作用，本配方中纖維素作為主要主要碳源，只有能碳源，只有能分解纖維素的

7、微生物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖。 101102103104105106培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)（前置染色法）（前置染色法）剛果紅染色法剛果紅染色法（后置

8、染色法）（后置染色法）方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？補充：補充： 漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛

9、果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！當然分解纖維素的能就強！ 3下列對剛果紅染色法的敘述，不正確的是（下列對剛果紅染色法的敘述，不正確的是（ ）A.可以先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)可以先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng) B.可以在倒平板時就加入剛果紅可以在倒平板時就加入剛果紅C.既可以先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)，既可以先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)， 也可以在倒平板時就加入剛果紅也可以在倒平板時就加入剛果紅D.可以將剛果紅與培養(yǎng)基中的其他物質(zhì)混合后再滅菌倒可以將剛果紅與培養(yǎng)基中的其

10、他物質(zhì)混合后再滅菌倒 平板平板 D 5、挑選菌落、挑選菌落 挑取產(chǎn)生挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。一般即為分解纖維素的菌落。 接種到接種到纖維素分解菌的纖維素分解菌的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在基上，在30300 0C C 37370 0C C培養(yǎng)，可進一步培養(yǎng)，可進一步純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)。 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行還需要進行_實驗，纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。纖發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素

11、所產(chǎn)生的維素所產(chǎn)生的_ _ 含量進行定量測定。含量進行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液體液體 固體固體 五、課題延伸五、課題延伸分解分解纖維纖維素的素的微生微生物的物的分離分離纖維素酶纖維素酶種類、作用種類、作用剛果紅染色剛果紅染色篩選原理篩選原理實實驗驗設(shè)設(shè)計計土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)涂布培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纖維素土壤富含纖維素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鑒別染色鑒別課堂總結(jié)課堂總結(jié)挑選菌落挑選菌落比較比較項目項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型型目的目

12、的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原理理現(xiàn)現(xiàn)象象方方法法在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果果pHpH升高指示劑會變紅升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當纖維素被紅色復(fù)合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是

13、否有著色的觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型（物理）型（物理）目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法以尿素做唯一氮源以尿素做唯一氮源的選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基主要以纖維素粉做碳主要以纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)思考：

14、本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些中的實驗流程有哪些異同？異同？ 本實驗流程與課題本實驗流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌得到菌落。本課題通過落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。他步驟基本一致。 四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，