基因芯片實驗原理與方法

1、基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱DNA微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣 品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。詳細 實驗方法· 基因芯片實驗原理與方法 實驗材料· 組織或細胞樣本試劑、試劑盒· Oligo-dT (T15) - Roche· dNTPs· RNasin· Superscript II· Cot-1

2、DNA· EDTA· NaOH· Tris儀器、耗材· 掃描儀：ScanArray 3000· 圖像處理軟件：Genepix 3.0· Cartesian 7500點樣儀· 硅烷化玻片· PCR儀器· Scan Microarray一、目的本實驗的目的是學會cDNA芯片的使用方法。了解各種基因芯片的基本原理和優(yōu)缺點?；蛐酒@一技術(shù)方法在1991年的Science雜志上被首次提出，其高通量、并行檢測的特點適應了分析人類基因組計劃所提供的海量的基因序列信息的需要，可以說，人類基因組計劃是基因芯片技術(shù)發(fā)展的原

3、因，而對深人研究基因突變和基因表達的有效方法的需求又是促進基因芯片技術(shù)發(fā)展的動力。由于基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點，基誕生以來就受到科學界的廣泛關注，正如晶體管電路向集成電路發(fā)展的經(jīng)歷一樣，分子生物學技術(shù)的集成化正在使生命科學的研究和應用發(fā)生一場革命。根據(jù)固定在芯片載體上的核酸分子的不同，基因芯片可以分為cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。寡核昔酸芯片主要基于光引導聚合技術(shù)，該技術(shù)是Affymetrix公司開發(fā)的專利技術(shù)，由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應用。二、原理基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱DNA微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預定位

4、置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。基因芯片技術(shù)主要包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結(jié)果分析。1、芯片制備-目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術(shù)。以便能快速、準確地將探針放置到芯片上的指定位置。2、樣品制備-生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能

5、直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。 3、雜交反應-雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。4、信號檢測和結(jié)果分析-雜交反應后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關生物信息。目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩大類組成。以下分別介紹這兩類芯片的基本原理和特點：寡核苷酸芯片(Oligo

6、nucleotides Chip)概念：是指做在固相載體上的寡核苷酸微陣列。其制備方法以直接在基片上進行原位合成為主、有時也可以預先合成，再按照制備cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法，有幾種不同的工藝，其中最著名的是美國Affymetrix公司(bbb:/aaaaffymetrixaaa)的專利技術(shù)光引導化學合成法(Light-directed chemical synthesis process)。產(chǎn)品名為GeneChip。Affymetrix公司已公開的光引導化學合成主要過程如下：首先根據(jù)雜交目的確定寡核

7、昔酸探針的長度和序列。再由計算機設計出合成寡核苷酸時用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探針合成。光導原位合成技術(shù)的優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列，探針陣列密度可高達到每平方厘米一百萬個。而這種方法的主要缺點：一是需要預先設計、制造一系列掩模，造價較高：二是每步產(chǎn)宰較低因此合成探針的長度受到了限制。此外，原值合成的方法還有Incyte Phamaceuticals5公司(bbb/aaaincyteaaa)和Rosetta Biosystem Inc公司等使用的基于噴墨打印原理的原價合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by

8、ink-jet printer devices)。噴印裝置與普通的彩色噴墨打印機類似，用四種堿基液體取代墨盒中的彩色墨汁，通過計算機控制噴印機將特定種類的試劑噴灑到預定的區(qū)域上。沖洗、去保護、偶聯(lián)等過程與傳統(tǒng)的DNA固相原值合成技術(shù)相同。噴印法可以合成長度為4050 nt的寡核昔酸鏈，每步產(chǎn)率可以達到99，合成30nt的寡核昔酸產(chǎn)率可達70以上。日本佳能公司利用其獨創(chuàng)的“氣泡噴墨”技術(shù)，僅用24 pl溶液就可以在基片上整理出近百微米的小探針點每平方厘米可排布近20000個探針，克服了噴墨打印技術(shù)制備探針陣列密度較小的缺點。寡核昔酸芯片的雜交和檢測分析：樣品處理和雜交檢測方法與cDNA芯片是一致

9、的。由于寡核昔酸陣列多需要區(qū)分單堿基突變因此嚴格控制雜交液鹽離子濃度、雜交溫度和沖洗時間是雜交實驗成敗的關鍵。cDNA芯片（cDNA Chip）概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上固定的成千上萬個cDNA分子組成cD4A微陣列。整理cDNA芯片最常用的固相載體是顯微鏡載玻片，載玻片在使用前需要進行表面處理，目的是抑制玻璃片表面對核酸分子的非特異性吸附作用。常用的表面處理方法有氨基化法、醛基化法和多聚賴氨酸包被法。cDNA芯片的制備：制備cDNA芯片多用合成后點樣法(Spotting after synthesis)，簡稱點樣法。合成后點樣法使用的專用設備稱為點樣儀(

10、Arrayer)，目前有多家國外公司(如Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic Microsystems,Genomicssolutions等)生產(chǎn)點樣儀。點樣儀的主要部件是由計算機系統(tǒng)控制的電腦機械手。點樣時電腦機械手利用點樣針頭(Pin)從96或384檄孔板上蘸取cDNA樣品，按照設計好的位置點在載玻片表面。針頭的數(shù)目、機械手的移動時間、針頭清洗和干燥時間、樣品總數(shù)和載破片數(shù)目共同決定了點樣所需時間；針頭的直徑和形狀、樣品溶液的粘滯程度以及固相載體的表面特性決定了芯片上液滴的量和擴散面積。除點樣法以外，cDNA芯片也可

11、以用電子定位法(Electronic addressing)制備。美國Nanogen公司(bbb:/aaananogenaaa)最早使用這項技術(shù)，他們對空白片上的持定位點進行電活化，使相應活化點的表面帶有電荷，成為“微電極”，能夠吸附cDNA分子。帶有微電極的片子與樣品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附的微電極上，并與片子表面發(fā)生化學結(jié)合從而固定。用這種工藝制備的芯片的優(yōu)點是：微電極的電吸附作用可以提高與靶核酸的雜交效率。缺點是制備復雜成本較高。這種帶有微電極的芯片也稱為主動式芯片。許多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根據(jù)需要從公司定制。美國Incyte公司是顯著名的cDNA芯片提供商

12、之，其產(chǎn)名為GEMTM芯片，每張片子上最多可以含有10000點，對樣品中mRNA的檢出限達到2pg，對兩種來源樣品中的基因差異表達的檢出限為2倍。cDNA芯片的使用方法樣品制備和雜交樣品制備包括分離和標記兩個方面，有些樣品還嬰經(jīng)過核酸擴增放大這一步驟。樣品制備的一般過程是：提取待檢樣品中的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時標記上熒光(熒光標記為最常用的方法優(yōu)點是無放射性且有多種顏色可供使用；研究者可以根據(jù)需要選用其它標記方法，例如同位素標記法、化學發(fā)光法或酶標法；如果目的是研究兩種來源的組織細胞基因的差異表達，則分別提取兩種組織細胞的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別標記兩種不同顏色的熒光(如Cy

13、3和Cy5)，等量混合后與芯片進行雜交反應。雜交反應可以在專用的雜交儀(Hybridization station)或雜交盒(Hybridization chamber)內(nèi)進行。雜交儀能夠容納多張芯片，有利于雜交過程的自動化和雜交條件的標準化。單個反應可以在雜交盒里進行，斯坦福大學Patrick O.Brown教授領導的實驗室將整理雜交盒的詳細說明提供在互聯(lián)網(wǎng)，同時還提供了cDNA芯片設備、樣品處理與雜交的完整的實驗手冊和有關軟件的下載，網(wǎng)址是：bbb://pbrowri/index.html。雜交信號檢測和分析通常檢測芯片上的雜交信號需要高靈敏度的檢測系統(tǒng)閱

14、讀儀(Reader)，閱讀儀的成像原理分為激光共焦掃描和CCD成像兩種。前者分辨率和靈敏度較高，但是掃描速度較慢且價格昂貴。后者的持點與之相反。十祈一次標準的cDNA芯片雜交實驗產(chǎn)生的成干上萬個點的雜交信息，需要生物信息學手段的支持。已經(jīng)有多種讀取和分析雜交信號的應用軟件以及能夠與網(wǎng)絡公共數(shù)據(jù)庫連接進行數(shù)據(jù)分析的應用軟件、在NHGRI的問站可以下載用于圖像分析的軟件，還可以找到能夠與Genbank、Unigene等數(shù)據(jù)庫聯(lián)機工作的軟件包?；蛐酒炯夹g(shù)流程圖表1 基因芯片的主要類型及其簡要特點三、主要器材掃描儀：ScanArray 3000，General Scanning公司圖像處理軟件：

15、Genepix 3.0， Axon公司；Scan Microarray Analysis System ，GSI Lumonics公司Cartesian 7500點樣儀 Cartesian公司硅烷化玻片 TeleChem公司PCR儀器四、試劑組織或細胞樣本Oligo-dT (T15) - Roche dNTPs (in buffer 50 mM Tris pH 8) RNasin - Promega Superscript II - Life Technologies Qiaquick PCR purification system - QIAGEN 22 x 50 mm cover slip

16、s Cot-1 DNA - Life Technologies Poly dA - Roche Cy3 and Cy5-dUTP 0.5M EDTA 2M NaOH 1M HCl 1M Tris pH 8 100mM sodium acetate 20x SSC 20% SDS Deionized Formamide MilliQ Water Array chip (5k gene-chip from QIMR) Hybridisation chamber Dnase-, RNase-free 0.5 and 1.5 ml eppendorf tubes Plastic slide holders 2 litre beakers 五、操作（一）總RNA制備1、組織(或細胞)碾磨粉碎11、 將超低溫保存的組織(或細胞)材料迅速轉(zhuǎn)移至盛有液氮的碾缽中，用杵子不斷碾磨至粉狀。12、 稱取1.5g粉狀樣品，放入