BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀培訓(xùn)手冊(cè)范本

1、 .BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀FACS101 Handbook本課程介紹表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如希望進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站訂閱FACSinformation電子報(bào).tw/bdb/index.html。如需要本課程手冊(cè)，歡迎至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫熒光染色方法，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基本結(jié)構(gòu)1.1儀器本體：1. 電源開(kāi)關(guān)：在BD FACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動(dòng)儀器本體，再打開(kāi)計(jì)算機(jī)。2. 光學(xué)系統(tǒng)：BD FACSC

2、alibur 基本配有一支波長(zhǎng)488 nm 的氬離子雷射以BD FACSCalibur 基本型為例Ø FSC Diode 只收488 nm波長(zhǎng)散射光Ø SSC PMT 只收488 nm波長(zhǎng)散射光Ø FL1 PMT 熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長(zhǎng)515-545 nm）Ø FL2 PMT 熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長(zhǎng)564-606 nm）Ø FL3 PMT 熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長(zhǎng) >650 nm）3. 儀器面板：儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、及三個(gè)功能控制鍵。流速控制：LO： 樣品流速：12 ml /minMED：樣品流

3、速：35 ml /minHI: 樣品流速：60 ml /min功能控制：· RUN：此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動(dòng)室。（正常顯示綠色；黃色時(shí)表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓。）· STANDBY：無(wú)樣品或暖機(jī)時(shí)之正常位置，此時(shí)鞘液停止流動(dòng)，雷射功率自動(dòng)降低。· PRIME：去除流動(dòng)室中的氣泡，流動(dòng)室施以反向壓力，將液流從流動(dòng)室沖入樣品管，持續(xù)一定時(shí)間后，以鞘液回注滿流動(dòng)室。PRIME 結(jié)束，儀器恢復(fù)STANDBY狀態(tài)。4. 儲(chǔ)液箱抽屜：在主機(jī)左下方之儲(chǔ)液箱抽屜。可向前拉開(kāi)，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過(guò)濾器Sheath Filter，及空氣濾網(wǎng) Air f

4、ilter。請(qǐng)注意氣路減壓閥VENT TOGGLE之位置。· 鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運(yùn)行大約 3小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。鞘液筒蓋上有金屬環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。· 廢液筒：位于抽屜右側(cè)，容積4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。· 鞘液過(guò)濾器：0.22mm過(guò)濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進(jìn)入流動(dòng)室的鞘液是干凈的。· 氣路減壓閥：沿箭頭方向移動(dòng)閥門開(kāi)關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘液筒添加鞘液時(shí)，需要減壓。· 空氣過(guò)濾網(wǎng)：用于過(guò)濾

5、冷卻雷射的空氣。5. 上樣品區(qū)：上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個(gè)部分，一個(gè)是進(jìn)樣針 Sample Injection Tube，將樣本輸入流動(dòng)室，還有就是支撐架 Tube Support Arm、和液滴存留系統(tǒng) Droplet Containment System。· 進(jìn)樣針：是一根不銹鋼管，將細(xì)胞從樣本針中吸入流動(dòng)室。進(jìn)樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。· 支撐架：用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動(dòng)液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置：位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當(dāng)支撐架位于左側(cè)或右側(cè)位置時(shí)，真空幫浦就會(huì)啟動(dòng)，將

6、液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時(shí)，須注意將支撐架位于中位，以避免過(guò)多樣品被抽吸到廢液筒內(nèi)（當(dāng)支撐架位于中位，真空幫浦停止工作）。更換樣品時(shí)，讓儀器保持RUN的模式，使得進(jìn)樣針可以反沖；切換到STANDBY模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動(dòng)室中。1.2 Macintosh計(jì)算機(jī)與打印機(jī)：準(zhǔn)備您的細(xì)胞樣品1. 理想樣品濃度調(diào)至1-10 X 105 cells/ml？一般實(shí)驗(yàn)只需0.5 ml的樣品。2. 細(xì)胞樣品務(wù)必放至BD FALCON 352052 試管中，否則無(wú)法上機(jī)。3. 上機(jī)前務(wù)必去除樣品中之細(xì)胞團(tuán)塊，以防止管路堵塞？可使用附濾網(wǎng)BD FALCON試管 (Cat. No.35223

7、5) 或35-55 mm的尼龍篩網(wǎng)。4. 供流式分析的樣品是單細(xì)胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。表面抗原熒光染色的方法大致有兩種：直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本公司網(wǎng)站下載染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html · 直接免疫熒光染色· Lysed - No - Wash Procedure· Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27· Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure· Leukemia a

8、nd Lymphoma Procedure 1· Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay· 間接免疫熒光染色· 滴定抗體濃度· 常用試劑5. 如因特殊因素?zé)o法下載上述實(shí)驗(yàn)方法，請(qǐng)e-mail：yenchichen.tw或 austin_bdtwn.tw。二、開(kāi)機(jī)、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作2.1 FACS Calibur 開(kāi)機(jī)1. 開(kāi)啟細(xì)胞儀電源。2. 開(kāi)啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及MO機(jī)。3. 開(kāi)啟計(jì)算機(jī)。4. 確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的FACS Flow，確實(shí)旋緊 (鞘液筒容量為4L)。5.

9、 將廢液倒掉，并在廢液筒中加入200 ml 家用漂白水 (廢液筒容量為4L)。6. 將減壓閥方向調(diào)在加壓（Pressurize）位置。7. 排除液流管路與過(guò)濾器中的氣泡。8. 取下樣品管，執(zhí)行 PRIME 功能兩次。9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 兩分鐘。10. 可開(kāi)始分析樣品。2.2 FACS Calibur 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼鳎呵逑催M(jìn)樣管和外套管，防止進(jìn)樣管堵塞、或有染料殘留。1. 將樣品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上樣品，讓儀器的真空系統(tǒng)抽取約 1 ml 的液體。2. 將樣品支持架回正，按 HI RUN，然后讓 FACSClean 清洗管

10、路10分鐘。3. 按 Standby，取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能兩次。4. 取 2 ml dH2O，重復(fù)上述步驟1-3。5. 注意最后只留約 1 ml dH2O 在試管中。6. 按 STANDBY 五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼?，以保護(hù)雷射光源。）7. 倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。8. 將減壓閥放在VENT 漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。9. 退出軟件“File”à“Quit”(如有對(duì)話選項(xiàng)，選擇“Dont save”)。確認(rèn)退出計(jì)算機(jī)中所有BD應(yīng)用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲(chǔ)存?zhèn)浞荨?0. 關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！癝pecial”à“Shutdown”

11、。三、上機(jī)分析流程建議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn)，僅需準(zhǔn)備下列樣品。（1）Negative Control（不加任何抗體）。（2）CD3-FITC（FL1 單染）。（3）CD19-PE（FL2 單染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 雙染）。3.1 Calibur 開(kāi)機(jī)1. 先開(kāi)啟細(xì)胞儀本體再打開(kāi)計(jì)算機(jī)。 *秘技1：如順序相反，儀器和計(jì)算機(jī)之間無(wú)法建立正常通訊，無(wú)法執(zhí)行“connect to cytometer”。 解決之道，兩者都關(guān)機(jī)、然后以正確方式重開(kāi)。2. 向前拉開(kāi)儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。3. 儀

12、器會(huì)對(duì)鞘流液筒打氣加壓，請(qǐng)確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。 *秘技2：將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在VENT（箭頭方向）位置，按RUN功能鍵時(shí)將顯示橙黃色（表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓），正常為綠色顯示。3.2開(kāi)啟CellQuest 軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件4. 在蘋果菜單下點(diǎn)擊CELLQuest 啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。5. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開(kāi)鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框。6. 在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊Plot Source，選擇Acquisition (收

13、取) ，確認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024。在顏色方框中點(diǎn)擊Multicolor Gating（收取樣品時(shí)，門內(nèi)細(xì)胞將出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊OK。此時(shí)實(shí)驗(yàn)文件會(huì)出現(xiàn)FSC/SSC散點(diǎn)圖。7. 說(shuō)明：散點(diǎn)圖（Dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來(lái)修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H 1024、FL2-H

14、 1024。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細(xì)胞大小，SSC：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。8. 從屏幕上方Plots菜單中選擇Dot Plot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H 1024，Y軸：FL2-H 1024。點(diǎn)擊OK，F(xiàn)L1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。9. 在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它設(shè)定在（x，y）（101，101）處，這些象限將指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域。建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊10. 從A

15、cquire菜單中選擇Connect to Cytometer，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)Acquisition Control 對(duì)話方框。如果無(wú)法選擇Connect to Cytometer，參考秘技 #1。如果沒(méi)見(jiàn)到Acquisition Control 對(duì)話，可到屏幕上方Windows菜單中選擇Show Acquisition Control。儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrument settings），含信號(hào)器高壓（Detector/ Amps），閾值（Threshol

16、d），熒光補(bǔ)償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps - Threshold - Compensation。11. 檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口確認(rèn)FSC與SSC為L(zhǎng)IN（線性放大），其它FL1-3為L(zhǎng)OG（對(duì)數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。12. 從Cytometer菜單中選擇Threshold，出現(xiàn) Threshold 窗口在Threshold 窗口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。13

17、. 從Cytometer菜單中選擇Compensation，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。3.3 上樣品、設(shè)置儀器14. 使儀器處于High RUN，支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù))，點(diǎn)擊Acquire。 調(diào)節(jié)FSC/SSC探測(cè)器（電壓）15. 觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓(Voltage)預(yù)設(shè)為E00，可調(diào)節(jié) Amp Gain 從1.009.99 使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC

18、電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射的二維位圖，即散射光圖譜（Scatter Plot），來(lái)圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。16. 在工具板中選擇多邊形的Region，在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來(lái)

19、圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates Region list ，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫(huà)R1。17. 選取希望Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖，從Plots菜單中選擇Format dot plot。在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將No Gate 改選 G1=R1。點(diǎn)擊OK。 調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測(cè)器（電壓）18. 點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓，使Negative Control細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之

20、100-101處。19. 在Threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值>52，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。 20. 點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，關(guān)閉Detector/Amps、Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說(shuō)明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過(guò)此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。21. High

21、RUN，換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽(yáng)性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過(guò)點(diǎn)擊­¯來(lái)選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pause。22. 移去單染CD3，換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Restart。調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pause。23. 最后以CD3-FIT

22、C/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Restart，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。24. 移去樣本管，換上dH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。3.4收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)25. 預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition & Storage，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)Collection Criteria從10000 of A

23、ll，再點(diǎn)擊OK。 26. 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。從Acquire 菜單中選擇Parameter Description，出現(xiàn)Parameter Description對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇Your Folder或新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select Your Folder。27. 命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊Parameter Description對(duì)話方框的File，出現(xiàn)文件名編輯窗口。在Custom Prefix中：輸入文件名20031231，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。28. Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的

24、空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。計(jì)數(shù)器Counters29. 從Acquire 菜單中選擇Counters. 窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)30. 你可以開(kāi)始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。HIGH RUN，將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在Acquisition Control窗口中，將 ý Setup 改成 ¨ Setup，此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示 Your Folder：20031231.001為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire” 便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)

25、儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件20031231.001，并會(huì)以“嘟”聲告知，CellQuest會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成20031231.002。等待下一指示。31. 你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire” 啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。可繼續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。3.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲(chǔ)存與備份：32. 不建議長(zhǎng)期使用硬盤儲(chǔ)存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤（如配有 CD-RW）、口袋硬盤（Flash Drive）來(lái)備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響數(shù)據(jù)處理速度?？蓪浞莺笾?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計(jì)算機(jī)或個(gè)人PC進(jìn)行離機(jī)分析。33. 確認(rèn)所有檔案皆己備份后，以鼠標(biāo)圈選欲

26、刪除數(shù)據(jù)，將其拖拉至Trash筒。退出軟件34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。35. 從屏幕上方 Cytometer 指令欄，選擇Instrument Setting，出現(xiàn)Instrument Setting窗口。點(diǎn)系print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊Save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)系SAVE后會(huì)出現(xiàn)文件保存對(duì)話方框，選擇文件目錄及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），點(diǎn)擊Save。點(diǎn)擊Done。36. 檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方 A

27、cquire 指令欄中，選取Disconnect to Cytometer 以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File”à“Quit”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“Dont save”)，進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約1 ml，再將樣品架置于中位 HI RUN 十分鐘。改用 2 ml DI water。重復(fù)上述程序，樣品架上留約 1 ml DI water 。按STANDBY五分鐘。關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī)四、數(shù)據(jù)分析FCS list mode數(shù)據(jù)文件：說(shuō)明：FCS list mode數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格

28、式檔案（FCS2.0）。該文件含有從流式細(xì)胞儀收取的平均10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有46個(gè)參數(shù)。一般軟件無(wú)法打開(kāi)list mode數(shù)據(jù)文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析軟件，才可開(kāi)啟、繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。4.1 開(kāi)啟一CellQuest實(shí)驗(yàn)文件1. 從屏幕上方File 菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。4.2散點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析（雙色）2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至適當(dāng)大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot

29、對(duì)話框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis，可點(diǎn)擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來(lái)開(kāi)啟預(yù)存之 Sample Files，它們的路徑位于Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來(lái)打開(kāi)次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來(lái)開(kāi)啟 NORM001 檔案。X 與 Y 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值FSC-H 256 與 SSC-H 256，在Color方框中點(diǎn)擊Multicolor Gating，確認(rèn)無(wú)誤之后，點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè) NORM001 的 FSC /SSC散點(diǎn)圖。4.

30、 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor 移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫(huà)出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來(lái)圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates Region list，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫(huà)R1。)5. 從Plots菜單中選擇Dot Plot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Dot Plot 對(duì)話方框。點(diǎn)擊X Parameter 鈕來(lái)顯示 NORM001 檔案中所有的參數(shù)項(xiàng) (FSC, SSC, FL1, FL2) 將 X

31、參數(shù)項(xiàng)改成FL1-H 256 Gamma-1，Y 參數(shù)項(xiàng)改成FL2-H 256 Gamma-2。從Gate輸入欄中將 NoGate 改成G1= R1。6. 點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè)以 G1 圈選的 FL1/ FL2 散點(diǎn)圖，可將復(fù)制圖移至原圖右方。NORM001 檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來(lái)界定陰性與陽(yáng)性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散點(diǎn)圖中心處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。8. FL1/ FL2 二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從屏幕上方Stats菜單中選擇Q

32、uadrant Stats?？梢缘玫皆搱D之四象限統(tǒng)計(jì)結(jié)果。UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9. 從屏幕上方File菜單中選擇Print One，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇Export Statistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。4.3 開(kāi)啟其它List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇N

33、ext Data File，軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來(lái)替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。12. 對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Change Data Files，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Quadrant Marker陰陽(yáng)界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。13. 常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 (內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告) ，我們建議您將它另存新

34、檔 File Save As，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。4.3直方圖之統(tǒng)計(jì)分析（單色）1. 從屏幕上方File 菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot對(duì)話框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis，可點(diǎn)擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來(lái)開(kāi)啟預(yù)存之 Sample Files，它們的路徑位于Mac HD：BD Applications：

35、CellQuest Folder：Sample Files。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來(lái)打開(kāi)次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來(lái)開(kāi)啟 NORM001 檔案。X 與 Y 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值FSC-H 256 與 SSC-H 256，在Color方框中點(diǎn)擊Multicolor Gating，確認(rèn)無(wú)誤之后，點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè) NORM001 的 FSC /SSC散點(diǎn)圖。4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor 移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫(huà)出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來(lái)圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選Gates

36、Region list，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫(huà)R1。)5. 從Plots菜單中選擇Histogram，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Histogram 對(duì)話方框。點(diǎn)擊 Select File 鈕，再點(diǎn)擊 Open來(lái)開(kāi)啟 NORM001 檔案。說(shuō)明：直方圖（Histogram）表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系，在圖中，橫坐標(biāo)X軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)（channel number），縱坐標(biāo)Y軸則通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對(duì)細(xì)胞數(shù)。6. 點(diǎn)擊 Parameter 鈕來(lái)顯示 NORM001 檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成FL2

37、-H 256 Gamma-2。從Gate輸入欄中將 No Gate 改成G1= R1，點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè)以G1圈選的 FL2直方圖，圖形的 X 軸為橙黃色熒光強(qiáng)度，Y 軸為細(xì)胞頻率，NORM001 檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來(lái)界定陰性與陽(yáng)性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 Histogram Marker 工具，然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是陰性信號(hào)的右緣。放開(kāi)鼠標(biāo)后即完成Marker 1(M1)。重復(fù)前述步驟以增畫(huà)另一Marker，一般而言 M2 始自 M1 的右緣，終于圖的右界。8. FL2 直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域，欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可

38、從 Stats 指令欄中選擇 Histogram Stats。打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9. 從屏幕上方File菜單中選擇Print One，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇Export Statistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。4.3 開(kāi)啟其它List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Next Data File，軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來(lái)替換現(xiàn)有檔

39、案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。12. 對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Change Data Files，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Markers界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。13. 常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 (內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告) ，我們建議您將它另存新檔 File Save As，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。五、錯(cuò)誤信號(hào)、

40、疑難排除5.1 儀器狀態(tài)（Status）： 在CELLQuest菜單位于Cytometer菜單中。用來(lái)在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問(wèn)題。狀態(tài)：顯示儀器運(yùn)行模式Not Ready：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Ready：樣本管放置在進(jìn)樣區(qū)，且支撐臂位于中位，樣本管加壓，儀器在RUN狀態(tài)。Standby：儀器在Standby 狀態(tài)、或儀器在Run 狀態(tài)而無(wú)樣本管在進(jìn)樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。Standby時(shí)儀器的雷射電源降低。5.2 常見(jiàn)故障排除程序5.2.1 樣品試管上不去Ø 誤用不適合的試管。（請(qǐng)用BD Falcon

41、352052）Ø 試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時(shí)鐘向下、逆時(shí)鐘向上）。Ø Bal Seal 磨損。（汰換 Bal seal）5.2.2 儀器處于N0T READY狀況檢查以下情況：Ø 鞘液筒中的鞘液是否用完。Ø 廢液筒中的廢液是否已裝滿。Ø 開(kāi)機(jī)需要5分鐘時(shí)間預(yù)熱。Ø 鞘液筒的液面檢測(cè)器連接是否松動(dòng)、或未連接。5.2.3 儀器處于STANDBY狀況（儀器失壓）如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于RUN模式，但儀器仍未能達(dá)到READY狀況，此時(shí)儀器仍處于STANDBY狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力閥未加壓，樣

42、本管不能被加壓等原因造成的壓力問(wèn)題。此時(shí)，樣本不能良好地進(jìn)入流動(dòng)室，無(wú)法檢測(cè)。此時(shí)，檢查以下情況：Ø 壓力閥未加壓。Ø 鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。Ø 樣本管是否有破損。Ø 上樣針上的Bal seal是否己磨損。Ø 鞘液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。5.2.4 儀器訊號(hào)噪聲過(guò)高鞘液過(guò)濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號(hào)，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以改變樣本流，造成檢測(cè)結(jié)果不理想；此時(shí)，儀器需要做PRIME，排除液路中的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了，應(yīng)該重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10次PRIME，再換上3ml dH2O上樣管HI

43、RUN 30分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之后，再進(jìn)行樣本測(cè)定。5.2.5 計(jì)算機(jī)屏幕上見(jiàn)不到細(xì)胞顯示檢查以下情況：Ø 如果儀器一直處于STANDBY狀態(tài)，則檢查System Status。Ø 如果STATUS窗日顯示READY，則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠，上樣前是否混勻了。Ø 檢查實(shí)驗(yàn)的Instrument Settings是否正確。Ø 檢查閾值是否設(shè)置過(guò)高，導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞群。Ø 檢查CELLQuest軟件Cytometer目錄下的Status窗口，是否己被更新。如果未更新，說(shuō)明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障，此時(shí)，應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī)和FAC

44、SCalibur，重新打開(kāi)儀器，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。Ø PRIME儀器液流，去除流動(dòng)室中可能存在的氣泡。若流動(dòng)室中存在氣泡，可能使樣本流的位置偏離激光束，導(dǎo)致無(wú)細(xì)胞信號(hào)。5.2.6 加樣針有鞘液反流檢查以下情況：Ø 檢查上樣針外管是否安好，可以將外管旋下，向上推動(dòng)，重新擰緊。Ø 更換上樣針上部的O型膠環(huán)。Ø 檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。如果樣本管支撐架位于旁位時(shí)，聽(tīng)不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉FACSCalibur，再啟動(dòng)；移開(kāi)支撐架時(shí)，如果馬達(dá)仍然不動(dòng)，請(qǐng)致電BD客戶服務(wù)部門尋求幫助。實(shí)驗(yàn)文件1：2 Color ACQ實(shí)驗(yàn)文件2：2 Color ANA表一、常用熒光染劑測(cè)量參數(shù)熒光染劑吸光波長(zhǎng)(nm)熒光波長(zhǎng)(nm)標(biāo)示抗體用染劑Fluorescein, FITC490520Phycoeryt