pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ppt課件

1、第一章第一章 PCR技術(shù)原理技術(shù)原理n 定義：定義： PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerase n chain reaction)，是通過模擬體內(nèi)，是通過模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制復(fù)制的的 n 方式，在體外選擇性地將方式，在體外選擇性地將 DNA 某個特殊區(qū)域某個特殊區(qū)域擴擴 n 增出來的技術(shù)。增出來的技術(shù)。n PCR技術(shù)技術(shù):PCR概念的提出概念的提出n1971年，美國麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。n1983，Kary Mullis

2、n1993年獲得諾貝爾獎引物引物引物引物技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高溫。thermus aquaticusTaq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)1988年年Saiki 等從溫泉等從溫泉（ Hot spring中分離中分離的一株水生嗜熱桿菌的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。聚合酶。 耐高溫，耐高溫， 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴大大提高了擴增片段特

3、異性和擴增效率，增加了擴增長度增長度(2.0Kb)。 酶命名為酶命名為Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。廣泛應(yīng)用。 在在 1989 年，年，Science 將將PCR中的中的Taq DNA多聚酶命多聚酶命 名為當(dāng)年的風(fēng)云分子名為當(dāng)年的風(fēng)云分子 (Molecule of the year) Taq DNA聚合酶優(yōu)點PCR技術(shù)的基本原理和工作方式模板DNA952.PCR工作方式PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特

4、點50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點72第2輪結(jié)束PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增3.PCR基本材料 模板：單鏈或雙鏈模板：單鏈或雙鏈DNA 引物：引物：16-30 bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐熱的聚合酶：耐熱的DNA聚合酶聚合酶

5、底物：四種脫氧三磷酸核苷底物：四種脫氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Mg2+： DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑 4.PCR反應(yīng)程序9496 30-3 預(yù)變性使模板預(yù)變性使模板DNA充分變性）充分變性）94 30 變性變性50-60 30-1 復(fù)性使引物與模板充分退火）復(fù)性使引物與模板充分退火）72 n(按按1擴增擴增1kb計算延伸計算延伸 72 3-7 總的延伸使產(chǎn)物延伸完整）總的延伸使產(chǎn)物延伸完整）4-10 保管保管 25-35個循環(huán)個循環(huán)5.PCR要素解析1復(fù)性和延伸溫度復(fù)性和延伸溫度 復(fù)性的溫度是復(fù)性的溫度是 PCR 擴增是否順利的關(guān)鍵因素，擴增

6、是否順利的關(guān)鍵因素，通常在通常在 50-60 之間。具體的溫度主要由引之間。具體的溫度主要由引物的物的 Tm 值決定低于值決定低于Tm 值值2-3 ）。）。 延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72 。如果復(fù)性的。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法同一溫度，變成二步法 PCR 。2反應(yīng)時間反應(yīng)時間 變性一般使用變性一般使用 30 秒鐘，如果模板的秒鐘，如果模板的 G+C 含含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時間可適量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。當(dāng)延長。 復(fù)性時間有復(fù)性時間有 30 秒種一般是

7、足夠的。秒種一般是足夠的。 延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用 1kb 用用 1 分鐘來保證充足的時間。分鐘來保證充足的時間。 5.PCR要素解析3循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為為 2535 次。次。 平臺效應(yīng)平臺效應(yīng)plateau effect）：）：PCR 擴增過程后期擴增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。 原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP 和和 DNA 聚合酶的穩(wěn)定性或

8、活性降低聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低 ，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底。度擴增產(chǎn)物變性不徹底。 5.PCR要素解析4PCR 反應(yīng)液的配制順序反應(yīng)液的配制順序 最后加入最后加入 DNA 聚合酶。聚合酶。 早期的早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。熱啟動熱啟動hot startPCR操作方式可較

9、好解決非特操作方式可較好解決非特異性擴增的問題。異性擴增的問題。 5.PCR要素解析5各種成分濃度作用：各種成分濃度作用：緩沖液：提供合適的緩沖液：提供合適的PH值和值和DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑 10mM TrisHCl （ pH8.3-9.0），），1.5mM MgCl2， 50mM K+ dNTP底物）：等摩爾濃度的底物）：等摩爾濃度的 4 種種 dNTP即即 dATP、 dTTP、dCTP和和dGTP），）， 終濃度一般為終濃度一般為 200mM即飽和濃度），即飽和濃度）， dNTP 的濃度會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和的濃度會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和忠實性。忠實性。 引物：引物：

10、 1M/L 5.PCR要素解析 長度：至少長度：至少 16bp ，通常為，通常為 18-25bp。更短的引物一般會降低擴。更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性增的特異性，但會提高擴增的有效性 引物的解鏈溫度：兩個引物之間的引物的解鏈溫度：兩個引物之間的 Tm 值差異最好在值差異最好在 2-5 。 對于小于對于小于 20 個堿基的引物其個堿基的引物其 Tm 值可用簡易公式計算，即值可用簡易公式計算，即 Tm=4G+C）+2A+T）。）。 避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體特別是引物的避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體特別是引物的 3端）。端）。 G+C 含量：盡量控制在含量

11、：盡量控制在 40% 至至 60% 之間，之間， 4 種堿基的分布應(yīng)種堿基的分布應(yīng) 盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及 T 在在 3 末末 端的重復(fù)排列。端的重復(fù)排列。 引物的引物的 3 末端最好是末端最好是 G 或或 C ，但不要，但不要 GC 連排。連排。5.PCR要素解析：引物設(shè)計6. PCR技術(shù)特點6. PCR技術(shù)特點6. PCR技術(shù)特點6. PCR技術(shù)特點1、2Taq PCR MasterMix2、DNA模板3、引物：本次實驗所用材料PCR反應(yīng)體系試劑試劑體積（體積（l）2Taq PCR MasterMix12.5P1 25u

12、M1P2 25uM1DNA模板模板 100ng1ddH2O to25PCR反應(yīng)程序955min1個循環(huán)個循環(huán)9530sec35個循環(huán)個循環(huán)6030sec7230sec7210min1個循環(huán)個循環(huán)4hold 瓊脂糖凝膠電泳n瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩和“電泳的雙重作用。瓊脂糖n瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足

13、道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中電荷效應(yīng)n瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中分子篩效應(yīng)nDNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃

14、度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分瓊脂糖凝膠的百分濃度（濃度（%）線狀線狀DNA分子的有效分子的有效范圍（范圍（Kb）0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1實驗材料n【資料】n1. 瓊脂糖n2. 10mg/ml EBn3. markern4. TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5M EDTA（pH8.0） 100mlddH2O to1000ml實驗步驟n【步驟】n1、稱1.5g瓊脂糖，加100ml電泳緩沖液1TAE加熱熔化。n2、膠液冷卻至60時，加入4l EB，小心混勻，緩慢倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子。n3、待膠凝固后，撥

15、出梳子，將模具置于水平電泳槽中，加入1TAE，讓液面高于膠面至少1mm。n4、上樣。n5、接通電泳儀電源，1-5V/cm電壓一般80100V），開始電泳。n6、根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳。切斷電源后，取出凝膠，使用凝膠成像儀進行觀察或拍照。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳DNA回收回收實驗原理離心吸附柱純化DNA的原理就是在離心吸附柱內(nèi)使用一種特殊的硅基質(zhì)濾膜，這種濾膜在低PH值、高濃度鹽鹽酸胍，NaI, NaClO4等存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會被吸附。再通過一系列漂洗、離心等步驟將殘留的引物、核苷酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。最后用低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈的DNA從濾膜上洗脫下來。利用硅基質(zhì)膜的過濾吸附操作，大大簡化了核酸純化過程，提供了一種快速、高通量的純化方式。除單管離心柱外，已經(jīng)有96孔板、384孔板等核酸純化產(chǎn)品。目前，硅基質(zhì)膜吸附法已經(jīng)成為目前核酸分離純化最主流的技術(shù)。通過該技術(shù)純化的DNA片段可直接用于的酶切、連接、測序、標(biāo)記和雜交等各種常規(guī)分子生物學(xué)操作。試劑盒組成及儲存方法名稱 用途溶膠/結(jié)合液 DA 溶膠（紅色）結(jié)合液DD無色 與DA混合后變?yōu)辄S色洗滌液W1洗滌液去鹽液W2洗脫鹽離子（75% EtOH）洗脫液EB洗