體外放射分析技術ppt課件

1、山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院體外分析發(fā)展史一、定義一、定義以放射性核素或其他非放射以放射性核素或其他非放射性物質標記的配體性物質標記的配體(Ligand)(Ligand)為示蹤劑，以配體和結合體為示蹤劑，以配體和結合體的結合反應為基礎，在試管的結合反應為基礎，在試管內進行的微量生物活性物質內進行的微量生物活性物質的檢測技術。的檢測技術。體外分析技術體外放射分析體外放射分析體外非放射分析體外非放射分析放射性競爭放射性競爭結合分析結合分析放射性非競放射性非競爭結合分析爭結合分析一、一、RIARIA的基本原理的基本原理（一競爭抑制結合反應：（一競爭抑制結合反應： 放射免疫分析

2、是在體外條放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標記抗原件下，由足量的非標記抗原AgAg與定量的標記抗原與定量的標記抗原（* *AgAg對限量的特異性抗體對限量的特異性抗體AbAb的競爭抑制結合反應。的競爭抑制結合反應。分析原理分析原理*Ag + AbAg+*Ag-Ab + *AgAg-Ab + Ag條件：*Ag與Ag免疫活性相同*Ag與Ab恒量*Ag與Ag總量大于Ab有效結合位點 A A g g + + * *A A g g + + A A b b * *A A g g A A b b + + A A g g A A b b + + f f r r e e e e * *A A g g +

3、+ + + + + + + + + + + + + + + （二劑量反應曲線：標準曲線（二劑量反應曲線：標準曲線 標記物與被測物之間的函數(shù)標記物與被測物之間的函數(shù)關系可以用劑量反應曲線來表示。關系可以用劑量反應曲線來表示。劑量反應曲線是用一系列標準抗劑量反應曲線是用一系列標準抗原反應而繪制出來的，所以又叫原反應而繪制出來的，所以又叫標準曲線。標準曲線。標準抗原標準抗原( (標準品標準品) )是廠家在試劑是廠家在試劑盒中提供的已知劑量的非標記抗盒中提供的已知劑量的非標記抗原。原。 標準曲線的繪制方法標準曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標準抗原和一定量用一系列已知濃度的標準抗原和一定量的標記抗原在

4、一定條件下同限量的特異的標記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進行反應；性抗體進行反應；在反應達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方在反應達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方法分離法分離B B和和F F；分別測量分別測量B B和和F F的放射性；的放射性；用反應變量如用反應變量如B/FB/F作為縱坐標，反應作為縱坐標，反應劑量作為橫坐標即一系列標準抗原劑量作為橫坐標即一系列標準抗原作一條曲線，就得到不同濃度的標準抗作一條曲線，就得到不同濃度的標準抗原對反應變量的競爭抑制曲線，這就是原對反應變量的競爭抑制曲線，這就是劑量反應曲線。劑量反應曲線。 標標 準準 曲曲 線線oAgoAg操作程序、試驗方法等操作程序、試驗

5、方法等 靈敏度很難超過靈敏度很難超過10-15g10-15g水平水平 Ag + *Ab Ag.*Ab + *Ab (過量）過量） (B) (F)2. 2. 三種主要反應試劑三種主要反應試劑 兩種主要反應試劑兩種主要反應試劑3. 3. 標記抗原標記抗原 標記抗體標記抗體4. 4. 復合物放射活度與復合物放射活度與 復合物放射活度與復合物放射活度與 待測抗原呈負相關待測抗原呈負相關 待測抗原呈正相關待測抗原呈正相關 5. NSB 5. NSB主要影響高劑主要影響高劑 NSBNSB主要影響低劑主要影響低劑 量反應量反應 量反應量反應RIA: 非標記 標記 抗體 抗原抗體 抗原 抗原 復合物IRMA:

6、非標記 標記 抗體 抗原抗體 抗原 抗原 復合物+或 測量范圍寬：標準曲線工作范圍寬測量范圍寬：標準曲線工作范圍寬,RIA ,RIA 為為2 2個個 數(shù)量級，數(shù)量級，IRMAIRMA可達可達3 3個數(shù)量級個數(shù)量級 需要二種需要二種McAbMcAb非放射標記的免疫分析法 化學發(fā)光分析 時間分辨熒光分析 酶免疫分析ECL反應原理：反應原理：化學發(fā)光反應導致光的發(fā)射是來自釕化學發(fā)光反應導致光的發(fā)射是來自釕Ru化合物的電的化合物的電的激發(fā)，而不是化學的激發(fā)。激發(fā)，而不是化學的激發(fā)。二二. .時間分辨熒光免疫時間分辨熒光免疫（time-resolved fluorescence immunossayti

7、me-resolved fluorescence immunossay TRFIA TRFIA）稀土族中的鑭系元素稀土族中的鑭系元素EuEu、TbTb、SmSm、DyDy等以離子價態(tài)時，等以離子價態(tài)時，受到紫外光或激光等激發(fā)后，會以熒光的形式發(fā)射光譜，其受到紫外光或激光等激發(fā)后，會以熒光的形式發(fā)射光譜，其激發(fā)光光譜的波長和發(fā)射熒光的強度因離子不同而有差異，激發(fā)光光譜的波長和發(fā)射熒光的強度因離子不同而有差異，而且具有相當長的衰減時間，這樣就為時間分辨熒光而且具有相當長的衰減時間，這樣就為時間分辨熒光 (TRF)(TRF)所發(fā)射的信號采集和多標記的應用提供了條件。所發(fā)射的信號采集和多標記的應用提供

8、了條件。TRFIATRFIA是一種以鑭系元素是一種以鑭系元素螯合物標記抗體或抗原，螯合物標記抗體或抗原，利用時間分辨熒光光度利用時間分辨熒光光度計測量法排除檢品中非計測量法排除檢品中非特異性熒光干擾的測量特異性熒光干擾的測量技術。技術。銪：銪： （Eueuropium）鋱：鋱： （Tbterbium）釤：釤： （Smsamarium）鏑：鏑： （Dydysprosium）原理：原理： TRFIATRFIA的標記物由鑭系元素螯合物與的標記物由鑭系元素螯合物與AbAb或或AgAg組成。組成。待測物通過免疫反應形成的復合物上，標有鑭系元素待測物通過免疫反應形成的復合物上，標有鑭系元素（ Eu3+Eu

9、3+），經(jīng)紫外線激發(fā)后會發(fā)出熒光。但連接在），經(jīng)紫外線激發(fā)后會發(fā)出熒光。但連接在復合物上的復合物上的EuEu發(fā)射的熒光很弱，需要將其游離出來再發(fā)射的熒光很弱，需要將其游離出來再形成一個能發(fā)射強熒光的絡合物。因此在免疫反應結形成一個能發(fā)射強熒光的絡合物。因此在免疫反應結束后，需向體系中加入一種束后，需向體系中加入一種“熒光增強劑熒光增強劑”，大大增，大大增加信號，所以該技術有時也稱為解離增強鑭系熒光免加信號，所以該技術有時也稱為解離增強鑭系熒光免疫分析疫分析DELFIADELFIA）。）。 所謂時間分辨是指所謂時間分辨是指Eu3+Eu3+受激活后產(chǎn)生壽命較長的受激活后產(chǎn)生壽命較長的熒光，而一般干擾熒光壽命較短，固可用儀器把測量熒光，而一般干擾熒光壽命較短，固可用儀器把測量時間定在每次激發(fā)后的數(shù)百時間定在每次激發(fā)后的數(shù)百s s之后才開始，干擾熒之后才開始，干擾熒光已衰減到很低水平，所取熒光信號是熒光衰減過程光已衰減到很低水平，所取熒光信號是熒光衰減過程的中間一段。的中間一段。螯合劑：異硫氰酸苯基螯合劑：異硫氰酸苯基-EDTA-EDTA