寡聚半乳糖醛酸對云南

1、1寡寡聚半乳糖醛酸對云南紅豆杉細胞懸聚半乳糖醛酸對云南紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中紫杉醇及浮培養(yǎng)中紫杉醇及10-10-去乙?；涂ㄍとヒ阴；涂ㄍど锖铣傻挠绊懮锖铣傻挠绊?專 業(yè)：生物制藥 作 者：許棟華 指導老師：王劍文 副研究員2背景簡介 紫杉醇紫杉醇(taxol) 作為一種作用機制獨特的植源性抗癌新藥。但由于紫杉醇天然含量很低，加上資源本身亦非常貧乏，因此限制了紫杉醇的進一步開發(fā)和應用。為了解決其藥源問題，科學家在尋找及擴大紫杉醇藥源途徑上（如篩選高產(chǎn)量紅豆杉栽培品種、化學合成、生物技術及微生物中生產(chǎn)等）進行了艱苦的研究工作。近年來，細胞培養(yǎng)技術已成為對紅豆杉屬植物研究的重要手段。 10-去

2、乙?；涂ㄍとヒ阴；涂ㄍ?（10-deacetyl baccatin ，10-DAB ） 是紫杉醇生物合成的重要前體物質(zhì)，本身亦有抗癌活性。法國研究小組發(fā)現(xiàn)10-DAB 可從歐洲紅豆杉的針葉中提取，其產(chǎn)率可達0.1%，10-DAB 的發(fā)現(xiàn)為通過連接紫杉醇側鏈半合成紫杉醇提供了較佳方法。迄今已在數(shù)種紅豆杉屬植物中分離到該成分。它不僅來源廣泛，而且提取的效率也較高，是一種較易檢測及廣闊開發(fā)前景的紫杉烷類物質(zhì)。 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）為果膠的不完全酶解產(chǎn)物，其單體半乳糖醛酸是組成植物細胞壁中果膠質(zhì)的主要成分，參與細胞壁復雜網(wǎng)架的形成。以OGA為誘導物，可誘導多種植物（如擬南芥、番

3、茄、胡蘿卜、馬鈴薯等）產(chǎn)生抗性反應，促進人參細胞中有效次生代謝產(chǎn)物人參皂苷的合成，本實驗測定結果可見，OGA可顯著提高云南紅豆杉細胞中10-DAB 及紫杉醇的含量。3第一部分第一部分 云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞生長云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞生長周期內(nèi)紫杉醇及周期內(nèi)紫杉醇及10-去乙?；涂ㄍとヒ阴；涂ㄍず康淖兓康淖兓诙糠值诙糠?寡聚半乳糖醛酸誘導云南紅豆寡聚半乳糖醛酸誘導云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳濃度的篩選杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳濃度的篩選第三部分第三部分 寡聚半乳糖醛酸誘導云南紅豆寡聚半乳糖醛酸誘導云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳收獲時間的篩選杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳收獲時間的篩選4第一部分第一部分 云

4、南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞生云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞生長周期內(nèi)長周期內(nèi)Taxol及及10-DAB 含量的變化含量的變化51 材料與方法材料與方法1). 云南紅豆杉細胞的培養(yǎng)云南紅豆杉細胞的培養(yǎng) 研究用的細胞系是經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的云南紅豆杉（T. yunnanensis）細胞株。在改良的MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。將生長良好的細胞3 g 轉入含30 mL MS液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，25，110 r/min黑暗振蕩培養(yǎng)。2). 紅豆杉細胞的處理紅豆杉細胞的處理 本實驗將云南紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)，分別于接種后第0、1、4、7、10、13、16、19、22 d 收獲細胞，提取紫杉醇及10-DAB ，HP

5、LC法檢測其含量，每種處理3個重復，共8組。3). 紫杉醇及紫杉醇及10-DAB 的含量分析的含量分析 色譜條件：10-DAB 含量測定：色譜柱（Restek C18柱：150 mm2.1 mm，5 m），流動相為甲醇-乙腈-水（2：3：8），檢測波長為232 nm，流速為0.2 mL/min，柱溫為35，進樣量為10 L。 Taxol含量測定：色譜柱（Restek C18柱：150 mm2.1 mm，5 m），流動相為甲醇-乙腈-水（25：35：45），檢測波長為227 nm，流速為0.2 mL/min，柱溫為35，進樣量為10 ml。6M in u te s051 01 52 0m A U

6、01 02 0M in utes0510152 0m A U01020 圖圖 1 10-DAB 及及紫紫杉杉醇醇標標準準品品及及樣樣品品色色譜譜圖圖 （*：10-DAB ；*：紫杉醇） * * M in u te s024681 0m A U01 0 02 0 0M in u te s024681 0m A U02 04 0 * * * 2 結果與討論結果與討論70.000.050.100.150.200.250.300.350.4001471013161922生長天數(shù) d干重 g10-DAB含量 mg/g DW0.00.51.01.52.02.510-DAB產(chǎn)量 mg/L干重 g含量 mg/

7、g產(chǎn)量 mg/L 0.000.050.100.150.200.250.300.3501471013161922生長天數(shù) d干重 g紫杉醇總產(chǎn)量 mg/L0.000.010.020.030.04紫杉醇含量 mg/g.DW干重總產(chǎn)量含量 圖圖 2 10-DAB 及及紫紫杉杉醇醇生生長長周周期期內(nèi)內(nèi)含含量量 8第二部分第二部分 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）誘導）誘導云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞濃度的篩選云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞濃度的篩選91 材料與方法材料與方法1) 紅豆杉細胞的培養(yǎng)紅豆杉細胞的培養(yǎng)（見第一部分1.1.1）2 )OGA誘導子的制備誘導子的制備多聚半乳糖醛酸經(jīng)果膠酶室溫下裂解20m

8、in，過濾，濃縮后凍干成粗OGA粉末。將OGA粉末配成1 g/L溶液，經(jīng)Sephdex G-10 柱處理濾除MW700的寡聚物，所得溶液濃縮后用0.45 m微孔濾膜過濾除菌，作為OGA誘導子備用。3 )紅豆杉細胞的誘導處理紅豆杉細胞的誘導處理 本實驗將培養(yǎng)的云南紅豆杉細胞分成對照組及處理組，處理組設4種不同誘導子濃度，分別為20、40、60、80 g/mL，對照組加入同量雙蒸水。每種處理4瓶，共4個重復。細胞培養(yǎng)至第17天加入OGA，繼續(xù)培養(yǎng)至第24天收獲。4 )10-DAB及紫杉醇的含量分析及紫杉醇的含量分析（見第一部分1.1.3）100.00.10.20.30.4020406080誘導子濃

9、度 mg/L干重 g10-DAB 含量 mg /g DW0.0000.0050.0100.0150.0200.025紫杉醇含量 mg/ g DW10-DAB干重紫杉醇 圖圖 4 不同濃度不同濃度 OGA 對對 10-DAB 及紫杉醇生物合成的影響及紫杉醇生物合成的影響 2 結果與討論結果與討論11第三部分第三部分 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）誘導云）誘導云南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳收獲時間的篩選南紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞最佳收獲時間的篩選121 材料與方法材料與方法1). 紅豆杉細胞的培養(yǎng)紅豆杉細胞的培養(yǎng)（見第一部分1.1.1）2 ). OGA誘導子的制備誘導子的制備（見第二部分1.1.2

10、）3 ). 紅豆杉細胞的處理紅豆杉細胞的處理 本實驗將云南紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)至第13 d加入誘導子OGA（40 mg/mL），25，110 r/min黑暗振蕩培養(yǎng)，分別于處理后第0、2、4、6、8 d收獲細胞，提取紫杉醇及10-DAB ，HPLC法檢測其含量，每種處理3個重復，共5組。4 ). 紫杉醇及紫杉醇及10-DAB 的含量分析的含量分析（見第一部分1.1.3）13Minutes05101520m A U01020Minutes05101520m A U01020 M inutes05101520m A U01020M inutes05101520m A U01020 圖圖 5 經(jīng)經(jīng) O

11、GA 處處 理理 后后 10-DAB 及及 紫紫 杉杉 醇醇 色色 譜譜 圖圖 （ *： 10-DAB ； *： 紫 杉 醇 ） * 2 結果與討論結果與討論 140.000.050.100.150.200.250.300.3502468生 長 天 數(shù) d干重g10-DAB總產(chǎn)量mg/L0.0000.0050.0100.0150.02010-DAB含量mg/g DW干 重總 產(chǎn) 量含 量0.000.050.100.150.200.250.300.3502468生 長 天 數(shù) d干重 g紫杉醇 含量mg/g DW00.10.20.30.40.50.60.70.80.9紫杉醇總產(chǎn)量 mg/L干 重含 量總 產(chǎn) 量 圖圖 6 經(jīng)經(jīng) O G A 處處 理理 后后 10-DAB 及及 紫