工業(yè)酶制劑蛋白酶

1、1工業(yè)酶制劑蛋白酶xxxx2 蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶。 凡是能水解蛋白質(zhì)的酶,在剛合成時都沒有活性,被稱為酶原。以無活性形式合成酶有利于酶的貯存及在機體內(nèi)的輸送、轉(zhuǎn)移。這種無活性的酶原可以通過自催化反應或通過金屬離子進行活化。31 產(chǎn)蛋白酶菌種研究狀況 1956以來，我國陸續(xù)選育了一批優(yōu)良產(chǎn)酶菌種，其中包括 中性蛋白酶生產(chǎn)菌枯草桿菌1.398,S114,172,放線菌166，棲土曲霉3.942； 堿性蛋白酶生產(chǎn)菌地衣芽孢桿菌2709，短小芽孢桿菌289，209； 酸性蛋白酶生產(chǎn)菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，漿油工業(yè)用的米曲霉3042。 美國曾規(guī)定，用在食品和

2、藥物的蛋白酶生產(chǎn)菌種都需經(jīng)食品和藥物管理局批準， 并嚴格限制在枯草桿菌，黑曲霉，米曲霉三種菌的菌株。42 酶蛋白的分類： 按酶蛋白的作用方式分： 內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，產(chǎn)物是短肽。 外肽酶：切開蛋白質(zhì)末端肽鍵形成少一單元的肽鏈和游離氨基酸，作用于氨基端的叫氨肽酶；作用于羧基端的叫羧肽酶。 水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵。 水解蛋白質(zhì)或多肽的酰氨鍵的。5按酶的來源分類： 植物蛋白酶。 動物蛋白酶。 微生物蛋白酶。按酶的最適pH分類： 酸性蛋白酶，最適pH2.0-5.0。 中性蛋白酶，pH7-8。 堿性蛋白酶，pH9.5-10.5。 為方便起見，微生物蛋白酶常用此分類法。6按酶的活性中心功能基團

3、分類： 絲氨酸蛋白酶（Serine protease)。 胰蛋白酶，糜蛋白酶，凝血蛋白酶等 巰基蛋白酶（Thiol protease）。 木瓜酶，無花果酶，某些鏈球菌蛋白酶 金屬蛋白酶（Metallo protease）。 許多微生物的中性蛋白酶73關于蛋白酶的專一性 蛋白酶的專一性一般情況下, 不是針對底物的專一性, 而是針對某些肽鍵的特異性, 不管蛋白質(zhì)的分子有多大, 但組成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類基本是一致的, 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的不同, 主要體現(xiàn)在氨基酸的比例和彼此排列順序的差異。蛋白酶的專一性主要是由于形成肽鍵的兩氨基酸的性質(zhì)不同所決定的。8 蛋白酶的底物專一性和水解肽鏈的能力,不僅受到切開

4、點一側(cè)或兩側(cè)相鄰氨基酸殘基的影響,甚至受間隔了若干單位的氨基酸殘基的影響.底物專一性上的微小差異,產(chǎn)生的生理功能可能完全不同.如胰蛋白酶,凝血酶和透明質(zhì)酸梅,三者在選擇性切開堿性氨基酸羧基側(cè)的肽鍵這點上,有共同之處,但作用于血纖維蛋白時,三者切開的肽鍵數(shù)不同.凝血酶使血液凝固,透明質(zhì)酸梅相反,起溶血作用,胰蛋白酶切開肽鍵最多,但兩種作用都很微弱.9 4. 微生物蛋白酶的酶系組成 細菌蛋白酶:枯草桿菌等芽孢桿菌生產(chǎn)中性或堿性蛋白酶,有些只一種,有些兩種皆產(chǎn). 霉菌蛋白酶:曲霉中米曲霉,黃曲霉及棲土曲霉以中,堿性蛋白酶為主;黑曲霉以酸性蛋白酶為主;根霉,青霉,擔子菌主要生產(chǎn)酸性蛋白酶. 酵母蛋白酶

5、:除解脂假絲酵母產(chǎn)生堿性蛋白酶外,大多數(shù)產(chǎn)酸性蛋白酶. 放線菌蛋白酶:生產(chǎn)中,堿性蛋白酶.105 主要蛋白酶及其性質(zhì)酸性蛋白酶 主要來源: 酸性蛋白酶主要來源于哺乳動物的消化道, 如胃蛋白酶; 部分微生物是酸性蛋白酶的主要來源, 如:目前的商品酸性蛋白酶制劑主要是由黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的。11一般性質(zhì): 分子特性: 酸性蛋白酶的最適pH在2-5范圍, 酶蛋白的等電點在pI3-5, 分子量MW30,000-35,000。 催化特性: 酸性蛋白酶的最適溫度因來源不同而有差異, 一般霉菌的蛋白酶的最適溫度較高, 大部分在50-60范圍, 而來源于動物胃粘膜的蛋白酶的最適溫度較低, 一般在40左右, 但酸性

6、蛋白酶的熱穩(wěn)定性都較差, 一般在50都很快失活, 此外, 酶的熱穩(wěn)定性還受到基質(zhì)的pH的影響; 有些酸性蛋白酶不耐低溫, 在低溫條件下,很快失活。許多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，對酶的穩(wěn)定有益。12酸性蛋白酶的活性中心 大多酶在其活性中心含兩個天冬氨酸殘基. 齋藤曲霉酸性蛋白酶中與活性相關的氨基酸是一個色氨酸,3個組氨酸和近20個酪氨酸,但色氨酸不在活性中心,而是牢固地結(jié)合在酶分子的疏水鍵上,有穩(wěn)定構(gòu)象的作用. 擬青霉酶分子中含-SH基.13 底物專一性: 許多霉菌產(chǎn)生的酸性蛋白酶需要較大分子的底物, 對蛋白質(zhì)的專一性較胃蛋白酶低, 胃蛋白酶作用過的底物蛋白, 可進一步用霉菌的酸性蛋白酶

7、進行水解。 幾乎所有來源于霉菌的酸性蛋白酶, 能裂解胰蛋白酶原的賴氨酸和異亮氨酸之間的肽鍵(Lys6Ile7), 將胰蛋白酶原激活, 利用此特異性, 可鑒別酸性蛋白酶制劑是來源于霉菌或其他來源。 14中性蛋白酶 中性蛋白酶是最早用于酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶, 目前的微生物生產(chǎn)的商品酶制劑的菌種主要有: 枯草桿菌、耐熱解蛋白芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、寄生曲霉、米曲霉、棲土曲霉。 除上述微生物生產(chǎn)中性蛋白酶外, 來源于植物的木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等都屬于中性蛋白酶。15一般性質(zhì): 分子特性: 大部分微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶, 一分子酶蛋白含有一個鋅原子, 酶蛋白的分子量在35

8、,000-40,000范圍, 等電點pI 8-9, 微生物蛋白酶中, 中性蛋白酶的穩(wěn)定性最差, 分子之間最容易發(fā)生自溶, 即使在低溫條件下, 也會發(fā)生明顯的自溶, 造成分子量明顯降低。16 催化特性: 中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性較差, 如 枯草桿菌的中性蛋白酶在pH7, 60處理15min, 失活90%; 棲土曲霉的中性蛋白酶在pH7, 55處理10min, 失活80%以上; 以酪蛋白為底物時, 枯草桿菌蛋白酶的最適pH7-8、熱解蛋白芽孢桿菌的中性蛋白酶的最適pH7-9、棲土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5; 最適溫度受測定時的反應時間有直接關系, 因為酶蛋白的穩(wěn)定性較差, 所以反應時間的長短影

9、響著反應結(jié)果, 一般在10-30min 最適溫度為45-50。鈣離子可以增加酶蛋白的穩(wěn)定性,并減少自溶。17關于中性蛋白酶的活性中心 大部分微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶的活性中心有一個鋅離子, 鋅離子起著酶蛋白與底物之間的橋梁作用,有些酶蛋白還含有鈣離子, 鈣離子具有穩(wěn)定酶蛋白空間構(gòu)象的作用; 此外, 鈣離子還與酶蛋白的熱穩(wěn)定性有關, 含有鈣離子的酶蛋白的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于不含鈣離子的蛋白酶。 利用酶蛋白的分子修飾技術, 研究發(fā)現(xiàn), 利用EDTA螯合作用除去中性蛋白酶的鋅離子, 然后置換成鈣離子, 這樣制備的中性蛋白酶結(jié)晶比原酶蛋白的活力提高了3倍。如果用錳離子置換鋅離子, 酶活力提高56%, 并且提

10、高了酶蛋白的熱穩(wěn)定性。18關于酶蛋白的專一性 微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶的最適底物是 Z-Gly-X-NH2, 其中X是疏水性氨基酸, 如果是絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、組氨酸時, 酶蛋白的活力明顯升高。19堿性蛋白酶 堿性蛋白酶主要是由微生物產(chǎn)生, 微生物中主要是細菌的部分菌種產(chǎn)生堿性蛋白酶, 目前堿性蛋白酶主要是用于洗滌劑、皮革工業(yè)、絲綢脫膠。20生產(chǎn)菌種 幾乎所有的細菌堿性蛋白酶都是胞外蛋白酶, 主要包括兩類: 其一是在中性條件下生產(chǎn)的堿性蛋白酶, 如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等; 其二是嗜堿微生物, 其必須在堿性條件下pH8-10才能生產(chǎn)的堿性蛋白酶。21一般性質(zhì) 酶蛋白特性: 堿性

11、蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小, 一般在20,000-34,000Da, 而且等電點較高, 一般在pH8-9。 催化特性: 大部分堿性蛋白酶的最適pH在7-11范圍, 當以酪蛋白為底物時, 最適pH為9.5-10.5, 堿性蛋白酶除能夠水解肽鍵外, 還具有水解酯鍵的能力和轉(zhuǎn)肽能力, 最適溫度因菌種不同而有差異, 一般在50 左右, 酶蛋白的熱穩(wěn)定性不高, 50-60處理15分鐘, 幾乎有50%的酶活力喪失, 我國目前生產(chǎn)的幾種堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性一般都在60以下。22堿性蛋白酶的活性中心 堿性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶, 其活性中心的主要功能基團是絲氨酸, 一部分天然蛋白質(zhì)能夠使堿性蛋白酶失

12、活, 如在土豆、大豆、大麥中含有一種蛋白質(zhì)是堿性蛋白酶的抑制劑。23堿性蛋白酶的專一性 微生物產(chǎn)生的堿性蛋白酶除具有水解肽鍵的能力外, 還具有較強的水解酯鍵的酯酶活力, 能夠水解各種對硝基苯基酯, 當酶制劑中混有中性蛋白酶時, 可以利用對硝基苯基酯作底物來測定堿性蛋白酶的活力, 以區(qū)別中性蛋白酶。24 根據(jù)微生物堿性蛋白酶水解肽鍵的羧基側(cè)氨基酸的專一性, 可將堿性蛋白酶分為4組: 對堿性氨基酸有專一性的( Lys Arg )類似于胰蛋白酶的堿性蛋白酶 對芳香族氨基酸有專一性的(Tyr Phe)枯草桿菌堿性蛋白酶 對脂肪族氨基酸有專一性的(Leu Ile Val)粘細菌-裂解型蛋白酶 對酸性氨基

13、酸有專一性的(Glu Asp )葡萄球菌堿性蛋白酶256 蛋白酶的應用 蛋白酶種類繁多，商品蛋白酶不下100種。不同來源的蛋白酶在工業(yè)上有不同的用途。蛋白酶已廣泛使用在皮革、毛紡、絲綢、日化、食品、釀造、醫(yī)藥等許多行業(yè)中。在食品工業(yè)中利用蛋白酶制劑，可以避免酸水解、堿水解對氨基酸的破壞作用及變旋，保證蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不受影響.26蛋白酶在食品工業(yè)中的應用 肉類加工中水解結(jié)締組織,嫩化肉類,軟化腸衣：利用蛋白酶對肉中的彈性蛋白和膠原蛋白進行部分水解，使肉類制品口感達到嫩而不韌、味美鮮香的效果。提高質(zhì)量.使用最多、作用最穩(wěn)定的蛋白酶是木瓜蛋白酶 面包、蛋糕加工中縮短揉面時間，增強面團延伸性。 乳酪制造中可凝固酪素，縮短凝乳時間 醬品制造中用于處理大豆或豆餅粉，提高蛋白質(zhì)利用率或縮短醬油、豆瓣醬發(fā)酵時間 酒類生產(chǎn)中用于啤酒、清酒澄清，防止渾濁: 豆奶生產(chǎn)中利用蛋白酶制劑可使苦澀味及豆腥味等異昧成分游離出來，通過吸附等方式較容易除去，又能提高蛋白質(zhì)的可溶性而提高蛋白質(zhì)得率。并且以中性蛋白酶效果最佳。2728其它方面的應用 皮革脫毛軟化：酶法脫毛由于酶水解