TILLING技術(shù)原理及其路線ppt課件

1、TILLING定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)原理及其路線中國農(nóng)業(yè)大學(xué)齊孟文; TILLING是后基因組時代出現(xiàn)的，一種將烷基化試劑EMS或輻射誘導(dǎo)的位點突變技術(shù)，與特定基因的PCR擴(kuò)增技術(shù)和突變單核苷酸多態(tài)性檢測技術(shù)或下一代基因俘獲高效測序技術(shù)相結(jié)合的反相遺傳學(xué)方法。提供了一種幾乎對所有物種都適應(yīng)的、低成本、高通量和自動化的誘發(fā)突變篩選技術(shù)。該技術(shù)也可用于天然群體自發(fā)突變的篩選，稱之為Eco-TILLING。;圖.基因誘變組學(xué)的正向和反向遺傳學(xué)操作的路標(biāo)。;技術(shù)特點點突變是隨機(jī)分布的飽和突變，可獲得大量的等位基因系列，對長度很小的基因，復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的反向遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)勢。誘變頻率高，為篩選特

2、定目的基因所需的突變?nèi)后w小。不依賴農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，無需耗時的基因操作和繁瑣的組織培養(yǎng)。但需要預(yù)先知道所研究基因的序列。;操作流程;操作流程 1用甲基磺酸乙酯處理種子誘導(dǎo)位點突變； 2播種誘變處理種子，按單株種植得到誘變M1代植株； 3播種M1代種子得到誘變M2代植株，自交獲得M2代種子并保存建庫； 4按單株提取M2代組織DNA，存放于96孔微孔板建庫； 55-8倍混合單株DNA庫，構(gòu)建DNA樣品池以增加掃描通量； 6針對目標(biāo)基因設(shè)計特異性引物，采用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記引物，對DNA目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增；; 7PCR的擴(kuò)增片段經(jīng)變性、退火，得到野生型和突變型堿基錯配

3、的異源雙鏈核酸分子； 8用特異性識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶cel切割異源雙鏈核酸分子，在錯配位點單鏈的3端切開； 9變性酶切產(chǎn)物得到完整單鏈(無突變堿基)和單鏈片段突變點被切開所致）； 10酶切產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離； 11用Photoshop對凝膠進(jìn)行圖像分析，如某一泳道有突變帶，則在700nm和800nm的圖像中，均會在野生型條帶下方看到一個新的條帶，這2個條帶片段大小之和等于野生型條帶長度，由新增2個條帶的移動距離可以大體上估計突變距目標(biāo)區(qū)域5或3的距離； 12回溯發(fā)現(xiàn)帶有突變的DNA池對應(yīng)的保存樣品，重復(fù)5-11過程鎖定突變單株。;TILLING分析過程。a. 1使用熒

4、光染料標(biāo)記基因特異性引物，對DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熱變性，然后退火隨機(jī)復(fù)性；3形成的錯配雙鏈DNA分子用S1內(nèi)切酶切割，然后變性；b.切割產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，以確定基因發(fā)生突變的DNA池。利用LI-COR凝膠系統(tǒng)的IRD700和IRD800兩個通道測定5和3標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小可以確定突變點在擴(kuò)增片段上的位置，在本例中大概離5端0 . 2 k b ， 3端 0 . 8 k b 的 距 離 。;圖.跑膠通道IRD800左和IRD700右的影像，誘變帶被框出，IRD700中的截圖標(biāo)在最右邊，注意一個通道的泳道浮現(xiàn)在背景上只有一個帶，另一通道是相應(yīng)的帶，二者大小相加等于

5、擴(kuò)增產(chǎn)物的全長最上端的帶），膠下端泳道的若干的條帶是隨機(jī)錯誤引導(dǎo)所產(chǎn)生的小片段。; 關(guān)鍵節(jié)點 1誘變過程 誘發(fā)突變既可采用金典的化學(xué)誘變?nèi)鏓MS，也可以采用物理誘變?nèi)巛椛湔T變，或者利用自然突變?nèi)后w。誘變過程應(yīng)進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)實驗，通過對誘變效率和致使效應(yīng)的折衷，選擇適合的誘變劑量。 是一種單功能烷化劑，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成缺電子的活潑中間產(chǎn)物，容易與堿基上的原子和磷酸基團(tuán)發(fā)生親核取代反應(yīng)，通過2條途徑使基因突變。一是堿基的烷基化效應(yīng)，鳥嘌呤的位易被烷基化，形成帶正電的季銨基團(tuán)，產(chǎn)生種可遺傳的效應(yīng)：促進(jìn)上的解離，使與配對，導(dǎo)致：轉(zhuǎn)換成：；削弱了位的糖苷鍵，發(fā)生脫嘌呤作用，如果脫嘌呤位點在復(fù)制之前未被修

6、復(fù)，則該位點在復(fù)制時將隨機(jī)插入任何一個堿基，經(jīng)過一輪復(fù)制后，可能發(fā)生：到：的轉(zhuǎn)換，也可能發(fā)生：到：或：的顛換；二是磷酸基團(tuán)的烷基化效應(yīng)，磷酸基上的原子被烷基化后，形成不穩(wěn)定的磷酸酯，容易發(fā)生水解，使核苷酸從磷酸與五碳糖間切斷，導(dǎo)致斷裂，產(chǎn)生染色體缺失。位點突變引起基因功能的改變主要包括：錯義突變，無義突變和剪接突變。; 2突變?nèi)后w 為了使突變能夠產(chǎn)生分離表型變異，突變?nèi)后w一般不選嵌合的M1代，而是選擇突變M2代，但是若是花粉誘變則可以選擇其M1代，如玉米品種。在知道誘變頻率的情況，產(chǎn)生目標(biāo)基因突變所需要的群體大小可以估算。 3DNA池 為了提高分析通量，一般構(gòu)建8倍的DNA樣品池，如果品種的突

7、變頻率較高，突變?nèi)后w較小時，樣品池也可以較小。構(gòu)建基因池時,要確保各個單株的DNA等量混合，為此一般分析平臺已采用機(jī)械手加樣。;圖.8倍池的構(gòu)建策略。; 4SNP檢測，酶切產(chǎn)物的凝膠電泳多采用的美國IE-Col公司的雙色紅外熒光檢測的專利技術(shù)分析，因為紅外光檢測的背景低，700nm和800nm通道間間沒有重疊，能有效的排除假陽性，可靠的發(fā)現(xiàn)和確定突變。 5改進(jìn)措施;圖.高通量TILLING的服務(wù)組織，最新和最期待的改進(jìn)。Squinting指的是輔助凝膠檢測，用當(dāng)前使用的GelBuddy軟禁確定新的DNA片段。; TbyS途徑 是指基于生物信息工具支撐的下一代測序技術(shù)在TILLING上的應(yīng)用，在

8、突變目的基因擴(kuò)增后直接高速測序，或采用外顯子俘獲策略，使誘變DNA與轉(zhuǎn)錄組寡核苷酸雜交后再進(jìn)行測序的途徑。;圖.（A傳統(tǒng)TILLING途徑；（B適應(yīng)于TbyS的途徑;圖.新一代高速測序流程圖。; 應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例水稻水稻; 玉米玉米; 3斑馬魚斑馬魚;參考文獻(xiàn)1.High-Throughput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiol.2019,126：4802.TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Mol Breeding . 2019,37: 143.TILLING without a plough: a new method with applications for reverse genetics. Current Opinion in Plant Biology 2019, 8:2112154.Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING. BMC Plant Biology 2019, 7:195.Discovery of induced point mutations in maize