經(jīng)典株與Nsp2變異株RTPCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、PRRSV經(jīng)典株與Nsp2變異株RT-PCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（檢驗(yàn)SOP）1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）經(jīng)典毒株與Nsp2基因缺失株的特異性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）區(qū)分技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于疑似感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的豬的組織、血液及其他病料樣品。2. 試劑2.1天根公司TIANamp Virus RNA Kit 病毒RNA提取試劑盒，目錄號：DP315-R2.2賽百盛公司 goldview2.3天根公司Quant One Step RT-PCR Kit，目錄號：KR113公司2.4瓊脂糖2.5分析純酒精（99.7%）2.6 6

2、5;DNA電泳Loading Buffer3實(shí)驗(yàn)室條件3.1儀器：PCR儀、臺式低溫高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、冰箱、紫外儀、微量移液器、水浴箱等。3.2從事PCR工作的實(shí)驗(yàn)室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出DNA提取區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。特別注意電泳后的瓊脂糖凝膠要及時處理，避免對實(shí)驗(yàn)室造成污染。4. 試劑的準(zhǔn)備4.1擴(kuò)增PRRSV的引物：PRRSV P1、PRRSV P2、PRRSV LOW。4.2 1.5%瓊脂糖凝膠加入0.1% goldview4.3 1×TAE緩沖液4.4 goldview4.5滅菌超純水4.6 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker DL1000）5. 操作步驟5.1

3、 樣品處理處理材料：a. 材料為發(fā)病豬只血液、血清或淋巴液可直接吸取140L。b. 材料為細(xì)胞上清液，可直接使用140L新鮮上清混勻。c. 材料為貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融三次，然后3000r/min離心5min，取上清液140L。d材料為病豬肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病料樣品時，需要先用生理鹽水或PBS進(jìn)行研磨，收集研磨物后反復(fù)凍融3次，12 000r/min離心10min，取上清140L。5.2 用移液器將560L Carrier RNA工作液（為裂解液RL與Carrier RNA溶液的混合液，配制方法如附錄配液表配制）加入一個干凈的1.5mL離心管中。注意：如果樣本體積大于1

4、40L，可等比例增加工作溶液和無水乙醇的用量。5.3 向離心管中加入140L檢測樣品（樣品需平衡至室溫），渦旋振蕩15秒混勻。注意：為了保證裂解充分，樣品和Carrier RNA 工作液需要徹底混勻。5.4 在室溫（15-25）孵育10分鐘。5.5 簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。5.6 加入560L無水乙醇，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒。注意：如果周圍環(huán)境高于25, 乙醇需要在冰上預(yù)冷后再加入。5.7 簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。5.8 仔細(xì)將離心管中的630L液體轉(zhuǎn)移至RNase-free吸附柱CR2（吸附柱放在2mL收集管中），蓋上管蓋，6000×g（8000rpm

5、）離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液體未能全部離心至收集管中，請加大轉(zhuǎn)速，延長離心時間至液體完全轉(zhuǎn)移到收集管中，如為組織苗，在過柱前請離心后將上清液過柱。5.9 重復(fù)此步驟7。5.10 小心打開吸附柱蓋子，加入500L溶液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），蓋上管蓋，6000×g（8000rpm）離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。5.11 小心打開吸附柱蓋子，加入500L溶液RW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），蓋上管蓋，6000×g （8000rpm）離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。5.12 將吸附柱放回收集管中，13,

6、400×g （12,000rpm）離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液。注意：乙醇的殘留可能會對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。5.13 可選步驟：將吸附柱放回2mL收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全變干。5.14 將吸附柱放入一個RNase-free 超凈離心管（1.5mL）中，小心打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入60L RNase-free ddH2O，蓋上蓋子，室溫放置5分鐘。6000×g （8000rpm）離心1分鐘。5.15 可選步驟：將上一步驟的洗脫液再次加入膜中央，并6000×g （8000rpm）離心1分鐘，以增強(qiáng)RNA洗脫效果。注意：確保洗脫

7、液（RNase-free ddH2O）在室溫平衡后再使用。如果加入洗脫液的體積很?。ㄐ∮?0L），為了將膜上的RNA 充分洗脫下來，應(yīng)注意將洗脫液加到膜的中央位置。洗脫體積可以根據(jù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求靈活處理，洗脫液（RNase-free ddH2O）加到吸附柱后，離心前在室溫放置5分鐘，有助于提高RNA 的產(chǎn)量。5.16 將提取的RNA樣品按照下條件進(jìn)行RT-PCR，剩余部分請及時放入-80保存（所有配置工作均在冰上進(jìn)行）。檢測設(shè)陰、陽性對照。配置如下體系：(25L體系)Rnase-free ddH2O 8.75L10×RT-PCRbuffer2.5LdNTP Mixture1.0L5&

8、#215;RT-PCR enhancer5.0LHotmaster Taq polymerase 1.25LQuant Rtase 0.25LRnase 0.25L擴(kuò)增引物(P1P2LOW) 各1.0LRNA模板 3.0LPRRSV檢測反應(yīng)條件：(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 30min 50(2) PCR預(yù)變性4min 94(3) 變性40s94(4) 退火40s 5535Cycles(5) 延伸40s 65(6) 延伸 10min 65(7) 保溫 165.17 電泳制備1.5%瓊脂糖凝膠板。取5L PCR產(chǎn)物與1L的上樣緩沖液（10×loading buffer）混勻后加入瓊脂糖凝膠板的加樣

9、孔中。加入分子量標(biāo)準(zhǔn)。蓋好電泳儀，插好電極，90V電壓電泳，1h。在紫外儀觀測下用數(shù)碼相機(jī)照相并進(jìn)行照片存檔。用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。6. 結(jié)果判定每次樣品應(yīng)當(dāng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陽性對照（經(jīng)典毒株與Nsp2缺失毒株）及空白對照，若待檢樣品擴(kuò)增出與經(jīng)典毒株標(biāo)準(zhǔn)陽性對照大小相同的特異性條帶且空白對照無條帶，即可判為經(jīng)典毒株感染；若檢測樣品擴(kuò)增出Nsp2基因缺失株標(biāo)準(zhǔn)陽性對照大小相同的特異性條帶且空白對照無條帶，即可判斷為Nsp2基因缺失毒株感染；未擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照大小相近的特異性條帶，則判為陰性；若空白對照擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照相似的條帶，則該次實(shí)驗(yàn)判為失敗，應(yīng)當(dāng)重新進(jìn)行一次RT-PCR檢測。

10、圖1 PRRSV的檢測結(jié)果M: Marker DL1000；+1為CH-1a株陽性對照，+2為經(jīng)典株陽性對照、+3為變異株陽性對照；1、2、3、4為樣品編號。注：藍(lán)耳變異株擴(kuò)增目的片段為180bp，藍(lán)耳經(jīng)典株擴(kuò)增目的片段為250bp。附錄:TAE電泳緩沖液(50×)1 0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液 (pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水 80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mL2 TAE電泳緩沖液(50)配制三羥甲基氨基甲烷(Tris) 242g冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0) 100mL 滅菌雙蒸水加至1 000mL 3 1%瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖1.5g TAE電泳緩沖液(1) 100mL微波爐中完全融化，加goldview5L 混勻。4. Carrier RNA 工作液的配制樣品個數(shù)RV(mL) Carrier RNA水溶液(L)樣品個數(shù)RV(mL) CarrierRNA水溶液1 0.56 5.613 7.28 72.82 1.12 11.214 7.84 78.4