螺旋體及檢驗

1、 懷化醫(yī)專微生物學檢驗教案 編號：2010年上學期授課教師桂 芳教研室主任審核簽名李爭鳴教學課題螺旋體及檢驗課時授課時間月 日 月 日 月 日 月 日 月 日 月 日2星期星期星期星期星期星期授課對象檢驗專業(yè)班級目的要求【掌握】鉤端螺旋體，梅毒螺旋體的生物學特性和微生物學檢驗。【熟悉】1、回歸熱螺旋體和伯氏疏螺旋體的特性。2、各類螺旋體的致病與免疫性?！玖私狻?防治原則和其他螺施體。教學重點及難點重點：1、螺旋體的概念與特征2、鉤端螺旋體的主要生物學性狀及微生物學檢驗3、梅毒螺旋體的主要生物學性狀及微生物學檢驗難點： 鉤端螺旋體、梅毒螺旋體的微生物學檢驗。教法與學法講授法課型理論課教學手段多媒

2、體教學內(nèi)容與時間分配1、概述：主要特點及分類。（10min）2、鉤端螺旋體：形態(tài)染色、培養(yǎng)、抗原構造與分類。致病性與免疫性，微生物學檢查及防治原則。（35min）3、梅毒螺旋體：形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、抗原構造。致病性與免疫性，微生物學檢查及防治原則。（35min）4、其他螺旋體。(10min)小 結 （10min）復習思考題1、什么叫螺旋體？有哪些特征？2、梅毒螺旋體的血清學檢測包括哪些試驗？其原理如何？參考資料1、張卓然主編 臨床微生物學與微生物檢驗人衛(wèi)出版社 第3版 2006.112、倪語星主編 臨床微生物學與檢驗 人衛(wèi)出版社 第4版， 2007年3、李凡主編 醫(yī)學微生物學 人衛(wèi)出版社 第7

3、版 2008.1自評本次課首先應重點講授螺旋體的概念與基本特征，尤其是與其他微生物的區(qū)別。其次是鉤端螺旋體、梅毒螺旋體的微生物學檢查及致病性，螺旋體常用的染色法是鍍銀染色法，該法的操作方法及結果觀察可以放在實驗課介紹。第二十七章 螺旋體及檢驗(spirochete)螺旋體是一類細長、柔軟、彎曲呈螺旋狀、運動活潑的原核細胞型微生物。生物學地位介于細菌與原蟲之間。有細胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，對抗生素敏感等。其中致病性螺旋體主要有鉤端螺旋體屬、疏螺旋體屬、密螺旋體屬等3個屬。第一節(jié) 鉤端螺旋體（Leptospira）有2種：問號鉤端螺旋體人畜共患?。浑p曲鉤端螺旋體不致病。一、生物學性狀1.

4、形態(tài)染色 螺旋細密、規(guī)則，形似細小珍珠排列的細鏈。一端或兩端呈鉤狀，故名鉤端螺旋體。運動活潑，常使菌體呈C、S或8字型。G-，但不易著色。常用Fontana鍍銀染色法，被染成棕褐色。暗視野顯微鏡下可見活潑運動、折光性強而成白色的鉤端螺旋體。2.培養(yǎng)特性需氧或微需氧，營養(yǎng)要求高，常用Korthof培養(yǎng)基，其中含10%新鮮滅活兔血清或牛血清，蛋白胨和磷酸鹽緩沖液（血清除促進鉤體生長外，還可中和其產(chǎn)生的毒性）。 適宜生長溫度為28-30，若11-13能生長的為非致病的雙曲鉤端螺旋體。最適pH7.2-7.6，pH < 6.5死亡，最高能耐pH8.4。在人工培養(yǎng)基中生長緩慢：液體培養(yǎng)基：28培養(yǎng)1

5、-2周，液體培養(yǎng)基呈半透明云霧狀生長。1%瓊脂固體：281-3周，可形成透明、不規(guī)則，d< 2mm的扁平小菌落 。生化反應不活潑，不分解糖類和蛋白質(zhì)，有過氧化氫酶，有的菌株可溶血。3.抵抗力 對熱和酸抵抗力弱，601min即死亡。0.2%來蘇、1:2000升汞、1%石炭酸經(jīng)1030 min被殺滅。對青霉素敏感。在夏秋季酸鹼度中性的濕土或水中可存活20天以上，甚至數(shù)月之久，這在本菌的傳播上有重要意義。4. 抗原構造與分類 1）屬特異性抗原（菌體抗原）：脂多糖復合物，用于分群。2）型特異性抗原（表面抗原）：多糖蛋白復合物，用于分型。問號狀鉤端螺旋體至少可分為25個血清群、273個血清型。 我

6、國已發(fā)現(xiàn)的致病性鉤端螺旋體至少有19個血清群、74個血清型，是發(fā)現(xiàn)血清型最多的國家。二、致病性與免疫性1、致病物質(zhì)（1） 內(nèi)毒素樣物質(zhì)(ELS)或稱脂多糖樣物質(zhì)(LLS)（2） 溶血素：溶解紅細胞，引起貧血、出血、肝腫大、黃疸、血尿。（3） 細胞毒性因子(CTF)：引起小鼠肌肉痙攣、呼吸困難而死亡。（4）細胞致病作用(CPE)物質(zhì)：56經(jīng)30分鐘被破壞。注射入家兔，可形成紅斑和水腫。 2、所致疾病 鉤端螺旋體?。ㄒ环N人畜共患傳染病）。儲存宿主：鼠和豬，其他：50多種動物（蛇、雞、鴨、鵝等）傳播途徑：人與污染水或土壤接觸,經(jīng)粘膜或破損皮膚進入;經(jīng)胎盤垂直傳播.臨床表現(xiàn)：大多隱性感染，隨尿排出。輕

7、重程度與感染鉤體型別、毒力、免疫性有關。輕者似感冒，重者引起內(nèi)臟器官和神經(jīng)系統(tǒng)的損害。先形成鉤體血癥,進入損傷全身毛細血管內(nèi)皮細胞及肝、腎、肺心及中樞神經(jīng)。疾病特點：起病急、高熱、乏力、全身酸痛、眼結膜充血、腓腸肌壓痛、表淺淋巴結腫大。免疫性：疾病后可獲得抗同型鉤體的持久免疫力。細胞免疫為主。三、微生物學檢查法（一）標本采集 鉤端螺旋體可從臨床標本、攜帶者和自然界的水中分離獲得。標本包括血液、尿和腦脊液，發(fā)病早期(10天內(nèi))血液的陽性率高，2周后尿和腦脊液等的陽性率高。感染610天取血可檢出抗體，在病程第3或4周達最高水平，此后抗體水平逐漸下降，血清學診斷則需在病程早期及恢復期分別采集血清，作

8、雙份血清試驗。 （二）檢驗方法 1、標本直接檢查（1）鏡檢：取急性期病人血先以1000rpm離心510min，再取血漿以4000rpm離心4560min，取1滴沉淀物置玻片上，加蓋玻片后作暗視野檢查。也可用Fontana鍍銀染色法染色后觀察。（2）核酸檢測：采用同位素或生物素、地高辛標記的特異DNA探針法，檢出標本中鉤端螺旋體的核酸，較培養(yǎng)法快速、敏感。若先用PCR技術先行擴增，再用探針確定，則敏感度更加提高。2、分離培養(yǎng) 取鉤端螺旋體血癥期的病人血液2ml 或發(fā)病后第2周的無菌弱堿性尿沉渣接種于Korthof 培養(yǎng)基中，28孵育，因系需氧生長，故靠近培養(yǎng)液面呈半透明霧狀混濁。取培養(yǎng)物作暗視野

9、檢查，觀察有無螺旋體生長，一般714天生長。連續(xù)觀察30d，如無生長方判為陰性。3、血清學檢測（1）顯微鏡凝集試驗（MAT） 是常用的方法。1)抗原制備：取標準菌株47天的培養(yǎng)物，每視野5060條活鉤端螺旋體。2)方法與結果：取病人血清以56，30min滅活后稀釋，每個稀釋度0.1ml 血清中加入等量活菌抗原，302h后，取1滴覆蓋玻片，暗視野顯微鏡下若有抗體存在，則鉤體凝集成團，數(shù)減少，當抗體效價高時，凝集的菌體溶解。 結果判定：50以上菌體凝集或溶解為“2+” 為血清效價。1：300才有診斷意義，或效價增高4倍以上，則可確診本病。 （2）酶聯(lián)免疫吸附試驗 用ELISA法和IgM斑點-ELI

10、SA法等間接檢測鉤體病人血清中特異性抗體，用于該病的快速診斷。 包被抗原用鉤端螺旋體培養(yǎng)物經(jīng)超聲波破碎，15000rmin離心20min，用于包被的抗原濃度以20gml為好。被檢血清OD值為陰性對照的2倍，即為陽性。4、動物試驗 動物是分離鉤端螺旋體的敏感方法，尤其適用于有雜菌污染的標本。 方法是將標本接種于幼齡豚鼠或金地鼠腹腔。接種35d后，可用暗視野顯微鏡檢查腹腔液；亦可在接種后36d取心血檢查并作分離培養(yǎng)。動物死后解剖，可見皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾臟器中有大量鉤端螺旋體存在。第二節(jié) 梅毒螺旋體（Treponema pallidum, TP）（蒼白密螺旋體蒼白亞種），STD中

11、危害最大的一種。一、生物學性狀1.形態(tài)與染色 8-14個致密而規(guī)則的小螺旋，兩端尖直，運動活潑。革蘭染色陰性，不易著染Fontana鍍銀染色法染成棕褐色。 電鏡下觀察，有細胞壁和細胞膜。細胞壁外有包膜，細胞膜內(nèi)為含細胞質(zhì)和核質(zhì)的螺旋形原生質(zhì)圓柱體。繞著34根周漿鞭毛或內(nèi)鞭毛 ，與運動有關。作移行、曲伸、滾動式運動。2、培養(yǎng)特性 不能在無活細胞的人工培養(yǎng)基中生長繁殖。 Nichols株能在家兔睪丸和眼前房內(nèi)繁殖并保持毒力，在細胞中能有限生長，繁殖慢，約30h才分裂一次 。含3%-4%氧時生長最宜 。 Nichols株：有毒力 Reiter株：毒力弱3.抵抗力 極弱。對溫度和干燥特別敏感。41.5

12、經(jīng)1h死亡，在50時5min死亡；在血液中，4置3d后可死亡。離體后1-2h將死亡。對常用化學消毒劑亦敏感，1%2%石炭酸內(nèi)數(shù)分鐘就死亡。對青霉素、四環(huán)素、紅霉素或砷劑均敏感。二、致病性與免疫性1、致病物質(zhì) 外膜蛋白-與宿主細胞粘附。 透明質(zhì)酸酶-利于擴散。宿主細胞纖維粘連蛋白覆于表面-免受宿主免疫細胞攻擊。2、所致疾病-梅毒 人是梅毒的唯一傳染源，有先天性和獲得性兩種 。 獲得性性接觸傳播先天性母體胎盤胎兒 獲得性梅毒期（初期）梅毒：感染性極強，破壞性小。感染后3周左右局部出現(xiàn)無痛性硬下疳，多見于外生殖器，一般48周后，常自愈。滲出液中有大量蒼白亞種螺旋體。期梅毒：感染性強，破壞性小。發(fā)生于

13、硬下疳出現(xiàn)后28周。蒼白亞種螺旋體血癥，全身皮膚、粘膜常有梅毒疹（扁平濕疣），全身淋巴結腫大，有時亦累及骨、關節(jié)、眼及其他臟器。在梅毒疹和淋巴結中，存在有大量蒼白亞種螺旋體。期(晚期)梅毒：感染性小，破壞性大。發(fā)生于感染2年以后，亦可長達1015年。病變可波及全身組織和器官。基本損害為慢性肉芽腫，局部因動脈內(nèi)膜炎所引起的缺血而使組織壞死。皮膚、肝、脾和骨骼常被累及。若侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管，可危及生命。先天性梅毒（胎傳梅毒）多發(fā)生于妊娠4個月之后。 蒼白亞種螺旋體經(jīng)胎盤進入胎兒血流，并擴散至肝、脾、腎上腺等大量繁殖，引起胎兒的全身性感染，導致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎；出生梅毒兒，呈現(xiàn)馬鞍鼻、鋸齒形牙

14、、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾等特殊體征。免疫性：抗體梅毒特異性抗體（IgG和IgM），有制動作用，對機體再感染有保護作用；抗脂質(zhì)抗體反應素（IgM和IgG混合物），對機體無保護作用，用于血清學診斷。三、微生物學檢查法標本 ：期梅毒-硬下疳滲出液；期梅毒-梅毒疹滲出液或局部淋巴結抽出液1.直接顯微鏡檢查 將上述檢材置于玻片上用暗視野顯微鏡檢查，如見有呈現(xiàn)運動活潑，沿其長軸滾動、屈伸、旋轉(zhuǎn)、前后移行等的螺旋體即有診斷意義。也可做鍍銀染色、熒光抗體染色或Giemsa染色。2.核酸檢測用PCR技術直接檢測臨床標本中梅毒螺旋體的特異性DNA片段，用于檢測的引物和探針是編碼外膜蛋白47kD的基因，其擴增產(chǎn)物

15、經(jīng)斑點印跡，或電泳Southern 印跡法鑒定。3.抗體檢測(1)非密螺旋體抗原試驗多用牛心肌的心脂質(zhì)作為抗原，測定病人血清中的反應素。將抗原包被到載體顆粒上，如：膽固醇（VDRL、USR）、活性炭（RPR）、甲苯胺紅（TRUST）。均為初篩試驗。初期梅毒病灶出現(xiàn)后1-2周時，陽性率為5383，二期梅毒的陽性率可達100，晚期梅毒的陽性率58-85，胎傳梅毒的陽性率為80- 100。1)性病研究所實驗室(VDRL)玻片試驗所用抗原(0.03心擬脂、0.21卵磷脂、0.9膽固醇，用無水乙醇配制)03ml加入裝有0.3ml緩沖鹽水的小瓶內(nèi)(1015ml容積)，加塞混勻。再加2.4ml緩沖鹽水即為抗

16、原懸液。待檢血清經(jīng)5630min滅活，滴加于玻片的漆圈內(nèi)加等量抗原液，搖轉(zhuǎn)玻片5min充分混勻反應后觀察結果。有大片絮狀凝聚物為(3+)，中等凝聚物為(2+)，細小凝聚物為(+)，液體混濁為()。2)快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗(RPR) 用活性炭顆粒吸附VDRL抗原。與反應素結合形成黑色凝集塊，可肉眼觀察結果。取待檢血清加于環(huán)狀卡圓圈內(nèi)，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋轉(zhuǎn)搖勻8min，觀察結果。在白色底板出現(xiàn)明顯黑色凝集顆粒為陽性，試驗結果用肉眼很容易判斷，不需顯微鏡，也易于推廣。3）不加熱血清反應素試驗（USR） 注意：以上試驗常有假陽性反應：結核、麻風、瘧疾、類風濕性關節(jié)炎、老年人、妊娠、

17、吸毒者等。(2)密螺旋體抗原試驗 （確證試驗） 用密螺旋體抗原檢測病人血清中特異性抗體，由于梅毒螺旋體、雅司螺旋體等抗原性相似，故血清學試驗不能區(qū)別這些密螺旋體及其所致疾病。 1)熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS) 先用吸收劑去除病人血清非特異性抗原，提高特異性，稀釋成不同稀釋度，加于預先涂有梅毒螺旋體抗原的玻片上，置濕盒內(nèi)，37孵育30min，洗片后再用熒光素標記的羊抗人丙球蛋白抗體，在熒光顯微鏡下觀察。陽性者可見發(fā)熒光的梅毒螺旋體。FTA-ABS試驗具高度特異性和敏感性，在第一期梅毒的頭幾天就可測出特異性抗體。2)梅毒螺旋體血凝試驗 (treponemal pallidum hem

18、aggulation assay, TPHA) 用抗原致敏紅細胞作間接血凝試驗是檢測抗體最簡易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋體(Nichols株)提取物去致敏經(jīng)醛化處理的綿羊紅細胞，病人的血清先與非致病性Reiter細胞。血清若含有抗體則與這些細胞反應形成平鋪孔底的凝集；用非致敏紅細胞作對照，以除外非特異性凝集。梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）第三節(jié) 疏螺旋體屬第四節(jié)有310個稀疏而不規(guī)則的螺旋，運動活潑。對人致病的主要有伯氏疏螺旋體、回歸熱螺旋體、奮森螺旋體等。一、伯氏疏螺旋體 是萊姆病的主要病原體，1977年在美國萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，從硬蜱及患者體內(nèi)分離出伯氏疏螺旋休。 1985年我國在黑龍江省林區(qū)首次發(fā)現(xiàn)萊姆病，1988