實驗九十微生物的生理生化反應(yīng)

1、1實驗九、十微生物的生理生化反應(yīng)微生物的生理生化反應(yīng)2一、目的要求一、目的要求n1.了解細菌的一般生化反應(yīng)；n2.了解細菌的生化鑒定方法其原理。3二、實驗材料二、實驗材料菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；自己分離的大腸桿菌。菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；自己分離的大腸桿菌。培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）(紫色液體內(nèi)帶指管）；紫色液體內(nèi)帶指管）；H2S試驗用培養(yǎng)基（黃色固體）；試驗用培養(yǎng)基（黃色固體）；蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，吲哚試驗用）；蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，吲哚試驗用）；淀粉培養(yǎng)基（黃色固體需融化倒平板）；淀粉培養(yǎng)基（黃色固體需融化倒平板）；葡萄糖

2、蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，甲基紅，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，甲基紅，VP試驗試驗用）用）*。試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；VP試劑。試劑。4三、實驗原理及方法三、實驗原理及方法由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質(zhì)由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，這種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)。微生物的代謝產(chǎn)物，這種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)。生化反應(yīng)常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生生化反應(yīng)常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的

3、微生物，例如：腸道細菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上物，例如：腸道細菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應(yīng)是微生物分類否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。鑒定的重要依據(jù)之一。51.糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵試驗是常用的生化反應(yīng)，在糖發(fā)酵試驗是常用的生化反應(yīng)，在腸道細菌腸道細菌的鑒定上尤的鑒定上尤為重要，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細為重要，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細菌的分解糖

4、類的能力上有相當大的差異，某些菌能使某些單糖菌的分解糖類的能力上有相當大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、或雙糖分解，并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸和氣體的產(chǎn)生氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的顏色變化和小套管內(nèi)氣泡的與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的顏色變化和小套管內(nèi)氣泡的有無來判定。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，指示劑溴甲酚紫由紫色（有無來判定。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，指示劑溴甲酚紫由紫色（pH6.8）變?yōu)辄S色（變?yōu)辄S色（pH5.2）。）。其步驟如下：其步驟如下：6（1）

5、取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管四支（內(nèi)裝有）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管四支（內(nèi)裝有小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置白對照。在各試管上標明菌名和組別，置37培養(yǎng)培養(yǎng)24小時觀察。小時觀察。大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、對照。大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、對照。78（2）觀察結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為）觀察結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生。陽性，

6、同時觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生?！?”+”表示產(chǎn)酸；表示產(chǎn)酸；“”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“-”-”表示陰表示陰性。性。92吲哚試驗 某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應(yīng)變化如下：哚，此為紅色化合物，其反應(yīng)變化如下：10（1 1）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和

7、組別，置明菌名和組別，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時。小時。 （2 2）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時再沿管壁慢慢加入吲哚試劑醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時再沿管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為陰滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為陰性。性。 （注意：加入試劑后不可再搖動，否則被混合，紅色不明顯。）（注意：加入試劑后不可再搖動

8、，否則被混合，紅色不明顯。） 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。113產(chǎn)硫化氫試驗 某些菌能分解含硫的有機物或無機物產(chǎn)生硫化氫（某些菌能分解含硫的有機物或無機物產(chǎn)生硫化氫（H H2 2S S），），H H2 2S S遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定的沉淀物。從而可斷定H H2 2S S的產(chǎn)生與否。的產(chǎn)生與否。 其測定方法有兩種：其測定方法有兩種： 一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有黑一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)

9、，看是否有黑色沉淀（本實驗采用）；色沉淀（本實驗采用）； 另一種是在盛有液體培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管另一種是在盛有液體培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變黑。的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變黑。其步驟如下：其步驟如下： 12（1 1）取）取H H2 2S S試驗用培養(yǎng)基四支（內(nèi)含有檸檬酸鐵銨），分別用試驗用培養(yǎng)基四支（內(nèi)含有檸檬酸鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空白，試管上注明菌名和組別，置支空白，試管上注明菌名和組別，置373

10、7培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時。小時。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生。產(chǎn)生。13144伏一普（Voges-proskauer）試驗， 即VP反應(yīng)某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉(zhuǎn)化萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉(zhuǎn)化成乙酰甲基甲醇，如加入強堿液，即與空氣中的氧成乙酰甲基甲醇，如加入強堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成起作用產(chǎn)生二

11、乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用生成紅色化合物，稱陽性反應(yīng)，沒有紅色化分作用生成紅色化合物，稱陽性反應(yīng)，沒有紅色化合物產(chǎn)生則稱陰性反應(yīng)。合物產(chǎn)生則稱陰性反應(yīng)。15實驗步驟：實驗步驟：（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別接種大腸桿菌，自己）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別。置注明菌名和組別。置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時。小時。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取

12、出，加入）培養(yǎng)后取出，加入5-105-10滴滴40%KOH40%KOH及等量的及等量的VPVP試劑液，用試劑液，用 力振蕩，放置力振蕩，放置3737溫室溫室15-3015-30分鐘，呈紅色者為陽性，不呈分鐘，呈紅色者為陽性，不呈 紅色者為陰性。紅色者為陰性。 165甲基紅試驗（MR試驗） 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量的某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量的酸，使酸，使pHpH降低至降低至4 45 5，它先產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被，它先產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示（有效紅指

13、示劑的變色而指示（有效pHpH范圍為范圍為4.24.26.36.3）。）。 細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色，細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應(yīng)。變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應(yīng)。17實驗步驟：實驗步驟： （1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，一支接種大腸桿菌，第二一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置37培養(yǎng)培養(yǎng)24小時。小時。大腸桿菌，自己分離的大腸桿

14、菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑3 34 4滴上層呈紅色滴上層呈紅色者為陽性。者為陽性。 186淀粉水解試驗 某些細菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶某些細菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。19實驗步驟：實驗步驟： （1 1）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至5050，以無

15、菌操作，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取少量枯草桿菌在平板的一邊劃制成平板。用接種環(huán)取少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+”+”字字形接種（或點種），另取少量大腸桿菌菌在平板的另一邊形接種（或點種），另取少量大腸桿菌菌在平板的另一邊接種，接種，在各培養(yǎng)皿底部標明菌名和組別在各培養(yǎng)皿底部標明菌名和組別。置。置3737溫箱中培溫箱中培養(yǎng)養(yǎng)16162020小時。小時。大腸桿菌，枯草桿菌。大腸桿菌，枯草桿菌。 2021（2 2）觀察結(jié)果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基）觀察結(jié)果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液均勻鋪滿整個平板。如上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液均勻鋪滿整個平板。如果在菌周圍

16、出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。透明果在菌周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。 22五、結(jié)果與思考題五、結(jié)果與思考題1 1將實驗結(jié)果填于書將實驗結(jié)果填于書P120P120表中表中試驗結(jié)果：試驗結(jié)果：“+”+”表示陽性反應(yīng)；表示陽性反應(yīng)；“-”-”表示陰性表示陰性反應(yīng)。反應(yīng)。 2 2細菌的生化反應(yīng)試驗意義何在？細菌的生化反應(yīng)試驗意義何在？ 23、糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵培養(yǎng)基，、糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵培養(yǎng)基，大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、空白空白對照。對照。2、H2S試驗：半固體培養(yǎng)基

17、，試驗：半固體培養(yǎng)基， 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌變形桿菌，空白對照。，空白對照。3 3、吲哚試驗：、吲哚試驗：蛋白胨水培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基； 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。4 4、淀粉水解試驗：、淀粉水解試驗：淀粉培養(yǎng)基到平板；淀粉培養(yǎng)基到平板；大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。5、VPVP反應(yīng)：反應(yīng)：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離

18、的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。6 6、甲基紅試驗（、甲基紅試驗（MRMR試驗）：試驗）：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。24.糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵試驗：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時觀察小套管中經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生。有無氣泡產(chǎn)生?！?”+”表示產(chǎn)酸；表示產(chǎn)酸；“”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“-”-”表示表示陰性。陰性。2.H2S試驗：試驗：培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生. .有有“+”+”3.3.吲哚試驗：吲哚試驗：在培養(yǎng)液中先加入乙醚約在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振 蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時再沿蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時再沿 管壁慢慢加入吲哚試劑管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽