課件14可見(jiàn)分光光度法

1、第六章第六章 儀器分析儀器分析上海市醫(yī)藥學(xué)校上海市醫(yī)藥學(xué)校Office:Office:藥物分析課題組藥物分析課題組2模塊一模塊一 紫外分光光度法紫外分光光度法第二節(jié)第二節(jié) 分光光度法分光光度法學(xué)習(xí)內(nèi)容：學(xué)習(xí)內(nèi)容：v 理解比色法和分光光度法的基本原理；理解比色法和分光光度法的基本原理；v了解紫外分光光度計(jì)的基本原理了解紫外分光光度計(jì)的基本原理 v學(xué)會(huì)紫外分光光度計(jì)的保養(yǎng)；學(xué)會(huì)紫外分光光度計(jì)的保養(yǎng)；工作內(nèi)容：工作內(nèi)容：v規(guī)范操作規(guī)范操作722s分光光度計(jì)分光光度計(jì)v 規(guī)范操作規(guī)范操作755B紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)3工作任務(wù)一工作任務(wù)一v使用使用722S722S型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀的吸收光

2、線型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀的吸收光線v使用使用722S722S型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀溶液的濃度型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀溶液的濃度 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 測(cè)定未知樣品的吸光度測(cè)定未知樣品的吸光度 求算未知樣品的濃度求算未知樣品的濃度 思考題的討論思考題的討論 完成實(shí)訓(xùn)報(bào)告書(shū)完成實(shí)訓(xùn)報(bào)告書(shū)4任務(wù)一：任務(wù)一： 722S722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟v 開(kāi)機(jī)、預(yù)熱開(kāi)機(jī)、預(yù)熱 v 確定濾光片位置確定濾光片位置 本儀器備有減少雜散光，提高本儀器備有減少雜散光，提高340340380nm380nm波段光度準(zhǔn)確性的濾光片，波段光度準(zhǔn)確性的濾光片，位于樣品室內(nèi)側(cè)，用一撥桿來(lái)改變位置。

3、位于樣品室內(nèi)側(cè)，用一撥桿來(lái)改變位置。 當(dāng)測(cè)試波長(zhǎng)在當(dāng)測(cè)試波長(zhǎng)在340340380nm380nm波段內(nèi)如作高精度測(cè)試可將撥桿推向前，波段內(nèi)如作高精度測(cè)試可將撥桿推向前， 通?？刹皇褂么藶V光片，可將撥桿置在通?？刹皇褂么藶V光片，可將撥桿置在4004001000nm1000nm位置。位置。5v 調(diào)整波長(zhǎng)調(diào)整波長(zhǎng) 使用儀器上波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕，即可方便地調(diào)整儀器當(dāng)前測(cè)試波長(zhǎng)，使用儀器上波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕，即可方便地調(diào)整儀器當(dāng)前測(cè)試波長(zhǎng)，具體波長(zhǎng)由旋鈕左側(cè)的顯示窗顯示，讀波長(zhǎng)數(shù)時(shí)目光垂直觀察。具體波長(zhǎng)由旋鈕左側(cè)的顯示窗顯示，讀波長(zhǎng)數(shù)時(shí)目光垂直觀察。v 調(diào)整功能鍵調(diào)整功能鍵 TRANS.TRANS.透射比透射比 AB

4、S.ABS.吸光度吸光度 FACT.FACT.濃度因子濃度因子 CONC.CONC.濃度直讀濃度直讀任務(wù)一：任務(wù)一： 722S722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟6v 調(diào)整透光率調(diào)整透光率 功能鍵放置于功能鍵放置于“T T” 調(diào)調(diào)100%100%：將用作背景的空白樣：將用作背景的空白樣品置入樣品室光路中蓋下試樣品置入樣品室光路中蓋下試樣蓋（同時(shí)打開(kāi)光門），按下蓋（同時(shí)打開(kāi)光門），按下“100%T100%T”鍵即能自動(dòng)調(diào)整鍵即能自動(dòng)調(diào)整100%T100%T（一次有誤差時(shí)可加按一（一次有誤差時(shí)可加按一次）。次）。 調(diào)調(diào)0%0%：打開(kāi)試樣蓋（關(guān)閉光門：打開(kāi)試樣蓋（關(guān)閉光門）或用不透光

5、材料在樣品室中）或用不透光材料在樣品室中遮斷光路，然后按遮斷光路，然后按“0%0%”鍵，鍵，即能自動(dòng)調(diào)整零位。即能自動(dòng)調(diào)整零位。 任務(wù)一：任務(wù)一： 722S722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟7v 測(cè)定吸光度測(cè)定吸光度 功能鍵放置于功能鍵放置于“A A” 改變?cè)嚇硬畚恢米尣煌瑯悠愤M(jìn)入光路改變?cè)嚇硬畚恢米尣煌瑯悠愤M(jìn)入光路 儀器標(biāo)準(zhǔn)配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的儀器標(biāo)準(zhǔn)配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的試樣槽拉桿來(lái)改變，打開(kāi)樣品室蓋以便觀察樣品槽中試樣槽拉桿來(lái)改變，打開(kāi)樣品室蓋以便觀察樣品槽中的樣品位置最靠近測(cè)試者的為的樣品位置最靠近測(cè)試者的為“0 0”位置，依次向外拉

6、位置，依次向外拉出相應(yīng)的為出相應(yīng)的為“1 1”“”“2 2”“”“3 3”位置，當(dāng)拉桿到位時(shí)有定位置，當(dāng)拉桿到位時(shí)有定位感，到位時(shí)請(qǐng)前后輕輕推動(dòng)一下以確定定位正確。位感，到位時(shí)請(qǐng)前后輕輕推動(dòng)一下以確定定位正確。 讀取數(shù)值并記錄。讀取數(shù)值并記錄。任務(wù)一：任務(wù)一： 722S722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟8任務(wù)二：吸收光譜曲線的繪制任務(wù)二：吸收光譜曲線的繪制教師演示教師演示v 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取高錳酸鉀（基準(zhǔn)）準(zhǔn)確稱取高錳酸鉀（基準(zhǔn)）0.125g,0.125g,在小燒杯中溶解，定量移入在小燒杯中溶解，定量移入1000mL1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻

7、度，搖勻。容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。v 試樣準(zhǔn)備試樣準(zhǔn)備 吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20mL20mL于于50mL50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻v 測(cè)定測(cè)定 1cm1cm比色皿，以蒸餾水作空白比色皿，以蒸餾水作空白 波長(zhǎng)選擇：波長(zhǎng)選擇：450450、460460、480480、500500、520520、525525（此處多選幾點(diǎn)）、（此處多選幾點(diǎn)）、530530、540540、560560、580580、600600 分別測(cè)定個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度分別測(cè)定個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度A A。v 繪制吸收光譜曲線繪制吸收光譜曲線 以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸收

8、度為縱坐標(biāo)，繪制曲線以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐標(biāo)，繪制曲線 找出最大波長(zhǎng)找出最大波長(zhǎng)maxmax。0(nm)525A9任務(wù)三：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制任務(wù)三：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)v標(biāo)準(zhǔn)系列溶液標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 取取6 6只只25ml25ml的容量瓶，分別精密加入高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的容量瓶，分別精密加入高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液0.000.00、1.001.00、2.002.00、3.003.00、4.004.00、5.00ml,5.00ml,加蒸餾水稀釋加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻至刻度，搖勻v測(cè)定測(cè)定 波長(zhǎng)選定為波長(zhǎng)選定為maxmax，以以1 1號(hào)為空白號(hào)為空白 依次測(cè)定依次測(cè)定2 26 6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系

9、列比色液的吸光度號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系列比色液的吸光度A A值。值。v繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)曲線。10任務(wù)四：樣品的測(cè)定任務(wù)四：樣品的測(cè)定學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)v樣品試液的配制樣品試液的配制 取取1 1只只25ml25ml的容量瓶，精密加入高錳酸鉀樣品液的容量瓶，精密加入高錳酸鉀樣品液5.00ml,5.00ml,（約含（約含KMnOKMnO4 40.5mg0.5mg）, ,加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。v測(cè)定吸光度測(cè)定吸光度 在相同條件下，測(cè)定樣品的吸光度在相同條件下，測(cè)定樣品的吸光度v計(jì)算計(jì)算

10、 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)濃度的從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)濃度的KMnOKMnO4 4 濃度，即為樣品比色液的濃度。濃度，即為樣品比色液的濃度。11概述概述v光譜分析光譜分析含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及光的吸收定律含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及光的吸收定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的分析方法。對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的分析方法。 分類：比色法、分光光度法分類：比色法、分光光度法v比色法比色法含義：比色分析法（簡(jiǎn)稱比色法）就是通過(guò)比較有含義：比色分析法（簡(jiǎn)稱比色法）就是通過(guò)比較有色物質(zhì)溶液顏色深淺測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法。色物質(zhì)溶液顏色深淺測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法。分類：目視比色法、光電比色法分類：目視比

11、色法、光電比色法12v目視比色法目視比色法 標(biāo)準(zhǔn)系列比色液標(biāo)準(zhǔn)系列比色液 樣品液與標(biāo)準(zhǔn)液比色樣品液與標(biāo)準(zhǔn)液比色概述概述一致一致13v 分光光度法分光光度法 含義：含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)光線的吸收程度已確定物質(zhì)含量的分析根據(jù)物質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)光線的吸收程度已確定物質(zhì)含量的分析方法。運(yùn)用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流計(jì)測(cè)量溶液透方法。運(yùn)用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流計(jì)測(cè)量溶液透射光的強(qiáng)度，并直接表示出透光率和吸收度，從而求得被測(cè)液濃度射光的強(qiáng)度，并直接表示出透光率和吸收度，從而求得被測(cè)液濃度或含量。或含量。 分類：紫外可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度法分類：紫外可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度

12、法一、概述一、概述14一、比色法和分光光度法特點(diǎn)一、比色法和分光光度法特點(diǎn)v靈敏度高靈敏度高 適用于測(cè)量微量物質(zhì)，最低濃度為適用于測(cè)量微量物質(zhì)，最低濃度為1010-5-5-10-10-7-7mol/Lmol/L，v有一定的準(zhǔn)確度有一定的準(zhǔn)確度 比色法相對(duì)誤差為比色法相對(duì)誤差為5-20%5-20%，分光光度法的相對(duì)誤差為，分光光度法的相對(duì)誤差為2%-5%2%-5%v操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速 只需要幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短只需要幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短v應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣 幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物均可直接或幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物均可直接或間接地用比色法或分光

13、光度法測(cè)定間接地用比色法或分光光度法測(cè)定15二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理比色法和分光光度法的依據(jù)是物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收比色法和分光光度法的依據(jù)是物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收v 光的基本性質(zhì)光的基本性質(zhì)光的波長(zhǎng)與其能量或頻率成反比關(guān)系光的波長(zhǎng)與其能量或頻率成反比關(guān)系 光的波長(zhǎng)越短，頻率或能量越高光的波長(zhǎng)越短，頻率或能量越高光的波長(zhǎng)越長(zhǎng)，頻率或能量越低光的波長(zhǎng)越長(zhǎng)，頻率或能量越低波粒二象性波粒二象性ChhEE光子的能量；h普朗克常數(shù)；C光的傳播速度光的頻率，Hz；光的波長(zhǎng)，nm16二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理v 常用波長(zhǎng)來(lái)表示各種不同的電磁輻射常用波長(zhǎng)來(lái)

14、表示各種不同的電磁輻射v 人眼睛能覺(jué)察到的波段稱為可見(jiàn)光，波長(zhǎng)范圍人眼睛能覺(jué)察到的波段稱為可見(jiàn)光，波長(zhǎng)范圍400-400-760nm760nmv 紅外線紅外線(760nm)(760nm)、紫外線（、紫外線（400nm400nm）、）、X X射線射線v 按照電磁波波長(zhǎng)大小順序可把電磁波劃分成幾個(gè)區(qū)按照電磁波波長(zhǎng)大小順序可把電磁波劃分成幾個(gè)區(qū)域，叫做光譜區(qū)域，由各光譜區(qū)域按順序排成的系域，叫做光譜區(qū)域，由各光譜區(qū)域按順序排成的系列叫做列叫做電磁波譜電磁波譜17電磁波譜電磁波譜181.1.光的性質(zhì)光的性質(zhì)v 單一波長(zhǎng)的光稱為單色光單一波長(zhǎng)的光稱為單色光v 由不同波長(zhǎng)的光混合而成的光稱為由不同波長(zhǎng)的光

15、混合而成的光稱為復(fù)復(fù)合光合光v 讓一束白光通過(guò)棱鏡，可分解為紅、讓一束白光通過(guò)棱鏡，可分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為光，這種現(xiàn)象稱為光的色散光的色散v 將兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度將兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合可成為白光，這兩種單色光比例混合可成為白光，這兩種單色光稱為稱為互補(bǔ)色光互補(bǔ)色光。19互補(bǔ)色光互補(bǔ)色光202.2.吸收光譜吸收光譜v 吸收光譜曲線吸收光譜曲線v 將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)一定濃度的溶液，測(cè)量每一將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)一定濃度的溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)各種單色光的吸收程度（吸收度波長(zhǎng)下溶液對(duì)各

16、種單色光的吸收程度（吸收度A A），然后），然后以波長(zhǎng)（以波長(zhǎng)（）為橫坐標(biāo)、吸收度（）為橫坐標(biāo)、吸收度（A A）為縱坐標(biāo)作圖，即）為縱坐標(biāo)作圖，即得一吸收光譜曲線。得一吸收光譜曲線。v 吸收度最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)，吸收度最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)，maxmax物質(zhì)吸收不同波長(zhǎng)的光的特性物質(zhì)吸收不同波長(zhǎng)的光的特性只與溶液中只與溶液中物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān), ,與溶液的與溶液的濃度無(wú)關(guān)濃度無(wú)關(guān). .不同物質(zhì)的光譜曲線不同不同物質(zhì)的光譜曲線不同吸收光譜曲線作為定性的依據(jù)吸收光譜曲線作為定性的依據(jù)A/nm525021 將不同波長(zhǎng)的單色光依將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)一定濃度的

17、溶液，次通過(guò)一定濃度的溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)測(cè)量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)各種單色光的吸收程度各種單色光的吸收程度（A A），以波長(zhǎng)（），以波長(zhǎng)（）為）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)得到的一條曲線。標(biāo)得到的一條曲線。濃度越大，吸收峰越高無(wú)關(guān)與溶液濃度Cmax峰谷吸收光譜曲線吸收光譜曲線max22LI0ItIa I I0 0 = I= Ia a + I+ It t透光率透光率吸光度吸光度%1000IITtTATAlg 1lg或或3.3.光的吸收定律光的吸收定律23朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律v 含義含義 當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)均勻、無(wú)散射均勻、無(wú)散射現(xiàn)象的溶液時(shí)，

18、在單色光強(qiáng)度、溶現(xiàn)象的溶液時(shí)，在單色光強(qiáng)度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度與溶液的液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度與溶液的濃度濃度和液層的和液層的厚度厚度的乘積成正比的乘積成正比。v 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 適用于適用于單色光單色光和和一定范圍的一定范圍的低低濃度濃度溶液溶液 溶液濃度過(guò)大，透光性質(zhì)發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正比關(guān)系溶液濃度過(guò)大，透光性質(zhì)發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正比關(guān)系 波長(zhǎng)較寬的混合光影響光的互補(bǔ)吸收，也會(huì)使測(cè)定產(chǎn)生誤差波長(zhǎng)較寬的混合光影響光的互補(bǔ)吸收，也會(huì)使測(cè)定產(chǎn)生誤差A(yù) = KcL24吸收系數(shù)吸收系數(shù)(K)(K)也稱吸光系數(shù)也稱吸光系數(shù)v百分吸收系數(shù)（比吸收系

19、數(shù)）百分吸收系數(shù)（比吸收系數(shù)）v摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù) = = v= = A = K c L=c(g/100mL) L(cm)AA c(mol/L) L(cm)10M濃度為濃度為1%(g/100mL)的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時(shí)的吸光度，時(shí)的吸光度，單位是單位是mL/(gcm)濃度為濃度為1mol/L的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時(shí)的吸光度，時(shí)的吸光度，單位是單位是L/(molcm)25v吸收系數(shù)在一定條件下是常數(shù)吸收系數(shù)在一定條件下是常數(shù)v與入射光的波長(zhǎng)、物質(zhì)的性質(zhì)、溶劑、溫度及儀與入射光的波長(zhǎng)、物質(zhì)的性質(zhì)、溶劑、溫度及儀器的質(zhì)量等因素有關(guān)器的質(zhì)量等因素有關(guān)v數(shù)值越大，表明有色溶液對(duì)光

20、越容易吸收，測(cè)定數(shù)值越大，表明有色溶液對(duì)光越容易吸收，測(cè)定的靈敏度越高的靈敏度越高v一般一般值在值在10103 3以上，即可進(jìn)行分光光度測(cè)定以上，即可進(jìn)行分光光度測(cè)定v吸收系數(shù)是定性和定量分析的重要依據(jù)吸收系數(shù)是定性和定量分析的重要依據(jù)26應(yīng)用應(yīng)用v氯霉素（氯霉素（M=323.15g/molM=323.15g/mol）的水溶液，在）的水溶液，在278nm278nm處有最處有最大吸收，設(shè)用純品配制大吸收，設(shè)用純品配制100mL100mL含氯霉素含氯霉素2.00mg2.00mg的溶液的溶液，以，以1cm1cm的吸收池，在的吸收池，在278nm278nm處測(cè)得吸光度為處測(cè)得吸光度為0.6140.614，求求和和v有一濃度一定的溶