RNA提取定量與RTPCR

1、第一部分第一部分 細(xì)胞總細(xì)胞總RNARNA的提取及定量的提取及定量 所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點：1.樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；2.有效地使核蛋白復(fù)合體變性；3.對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；4.有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；5.對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 p1010-5-5g RNA/g RNA/細(xì)胞細(xì)胞 pRNARNA分離的方法分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法；鹽酸胍：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法；鹽酸胍- -有機溶有機溶劑法；氯化鋰劑法；氯化鋰- -尿素法；蛋白酶尿素法；蛋白酶K-K-細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)RNARNA提取法；提取法；異硫氰酸胍異硫氰酸胍-

2、 -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法( (TrizolTrizol法法) )等。等。p目前常用的是目前常用的是TrizolTrizol法。法。pTrizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑p其主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白/核酸物質(zhì)解聚得到釋放。p酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。p在加入氯仿離心后，氯仿比重大，使溶液分為水相、中間層和有機相。RNA在上層水相中，DNA和蛋白質(zhì)位于中間層，有顏色的下層為

3、有機相。p取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA。pRNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。p嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。 p最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶：而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。1.焦碳酸二乙酯（DEPC) 是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 2.異硫氰酸胍 目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使

4、RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白體中解離可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白體中解離出來，又對出來，又對RNARNA酶有強烈的變性作用。酶有強烈的變性作用。 3.RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin) 從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 4.其他 SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6h或更長時間。 2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O

5、2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。 4.配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過濾除菌。 5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 6.設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。 樣品處理樣品處理p提取組織提取組織RNARNA時，每時，每5050100mg100mg組織用組織用1ml 1ml TrizolTrizol試劑對組織進(jìn)行裂試劑對組織進(jìn)行裂解；解；p懸浮細(xì)胞先離心沉淀，每懸浮細(xì)胞先離心沉淀，每5-10 5-10 1010

6、6 6個細(xì)胞加個細(xì)胞加1ml 1ml TrizolTrizol后，反復(fù)后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。p培養(yǎng)貼壁細(xì)胞不須消化，可直接用培養(yǎng)貼壁細(xì)胞不須消化，可直接用TrizolTrizol進(jìn)行消化、裂解，進(jìn)行消化、裂解，TrizolTrizol體積按體積按10cm10cm2 2/ml/ml比例加入。比例加入。 ( (注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量RNARNA的前提；細(xì)胞數(shù)量與的前提；細(xì)胞數(shù)量與TrizolTrizol的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過多。的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過多。) )實驗材料實驗材料：人胚胎腎細(xì)胞：人胚胎腎細(xì)胞

7、293293 1.細(xì)胞或組織加Trizol（RNAisoPlus）后劇烈振蕩15s，室溫放置5min，使其充分裂解。 （注意：此時可放入-70長期保持）2.按0.2ml 氯仿/1ml Trizol加入氯仿(本實驗加100l)，劇烈振蕩混勻后室溫放置5min。 (注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進(jìn)行。)3.4 12,000g離心15min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60。4.吸取上層水相，至另一離心管中。一般400-450l 就足夠了，寧少勿多！ （注：千萬不要吸取中間界面）5.加入等體積

8、異丙醇混勻，4放置5-10min。 6.4 12,000g離心10min，棄上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇洗滌RNA沉淀，（切勿觸及沉淀?。睾驼袷庪x心管，懸浮沉淀。 8.4 12,000g離心5min，盡量棄上清。 9.室溫晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。（注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。）10.加入10l無RNase的水，充分震蕩混勻。收集適量細(xì)胞，加500l Trizol用移液槍反復(fù)吹吸，直至裂解液中無明顯沉淀向裂解液中加100 l氯仿4, 12000g 離心15min吸取上清液200250 l 至另一新

9、離心管中(切忌吸出白色中間層)向上清中加入等體積等體積異丙醇混勻4, 12000g 離心10min緩慢沿離心管壁加入500l 75%乙醇4, 12000g 離心5min小心盡量棄去乙醇加入10l RNase-free水溶解沉淀備用室溫靜置5min蓋緊離心管蓋，用手振蕩15s室溫靜置5min上下顛倒離心管充分混勻室溫靜置10min小心棄去上清室溫干燥沉淀2-5min（1 1）（2 2）（3 3）（4 4）（5 5）（6 6）（7 7）（8 8）（9 9）洗滌離心管壁輕輕上下顛倒原原 理：理：1.物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng) 2.而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的3.各種不同的物質(zhì)都具有其各

10、自的吸收光譜因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.pRNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約 40g/ml 的單鏈RNA。用雙蒸水稀釋RNA樣品（1lRNA+49l水）倍并以雙蒸水為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度:dsDNA(雙鏈DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/mlpRNA純品:OD260 /OD280 2.0(1.82.0)，OD260

11、/OD230 2.0 p若OD260/OD280小于1.8，說明樣品中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。p若OD260/OD280大于2.0，則提示可能有異硫氰酸殘存或RNA降解。pOD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。pRNARNA得率低：得率低： A. A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.RNA B.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。pA260/A2801.65 A260/A2801.65 ： A.RNA A.RNA應(yīng)使用應(yīng)使用TE BufferTE Buffer稀釋后再進(jìn)行吸光度值的測定。稀釋后再進(jìn)行吸光度

12、值的測定。 低離子濃度和低低離子濃度和低pHpH值條件下值條件下A280A280值偏高。值偏高。 B. B.樣品勻漿時加的試劑量太少。樣品勻漿時加的試劑量太少。 C. C.勻漿樣品時未在室溫放置勻漿樣品時未在室溫放置5 5分鐘。分鐘。 D. D.吸取水相時混入了有機相。吸取水相時混入了有機相。 E.RNA E.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。pRNARNA降解降解 A. A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。組織取出后沒有馬上處理或冷凍。 B. B.待提取待提取RNARNA的樣品沒有保存于的樣品沒有保存于-60-60至至-70-70，而保存在了，而保存在了-5-5至至-20-20。 C. C

13、.細(xì)胞在用胰酶處理時過度。細(xì)胞在用胰酶處理時過度。 D. D.溶液或離心管未經(jīng)溶液或離心管未經(jīng)RNaseRNase去除處理。去除處理。 E. E.電泳時使用的甲醛電泳時使用的甲醛pHpH值低于了值低于了3.5 3.5 。pDNADNA污染污染 A. A.樣品勻漿時加的試劑量太少樣品勻漿時加的試劑量太少 B. B.樣品中含有有機溶劑樣品中含有有機溶劑( (如乙醇，如乙醇，DMSODMSO等等) )，強緩沖液或堿性溶液，強緩沖液或堿性溶液第二部分第二部分 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄- -聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) 以其中的mRNA作為模板分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

14、1.鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37。在長時間的逆轉(zhuǎn)錄過程中，不會造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長的cDNA鏈的合成。 2.禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。4.MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScript。此種酶較其它酶能多將更大部分的

15、RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。（一）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇（一）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇按下列組分配制按下列組分配制RTRT反應(yīng)液反應(yīng)液l l l l l 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下第一鏈第一鏈cDNAcDNA2 2 l lPerfectShotPerfectShot TaqTaq 1010 l l上游引物上游引物 (10 (10 M)M)1 1 l l下游引物下游引物 (10 (10 M)M)1 1 l lRNaseRNase Free H2O Free H2O總體積總體積6 6 l l2020 l l取取0.2 ml PCR0.2

16、 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑( (注注意每換一種試劑換一個新吸頭意每換一種試劑換一個新吸頭) )： 如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCRPCR反應(yīng)管置臺式離心機中瞬時離心，使反應(yīng)管置臺式離心機中瞬時離心，使反應(yīng)液集中于管底，反應(yīng)液集中于管底，將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR(PCR儀儀) )上上 .PCR 反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性30s， 60退火30s， 72 延伸45s。如

17、此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。 溫度9494變性變性（30s30s）55 55 退火退火（30s30s）72 72 延伸延伸（30s30s）循環(huán)1循環(huán)2 循環(huán)3 p瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度pDNADNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動. .pDNADNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與

18、分子篩效應(yīng)。不同的DNADNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶的區(qū)帶( (遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系).).1.1.電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。遷移率比溴酚藍(lán)慢。 2.2.染料：染料：GelviewGelview、EBEB3.3.電泳緩沖液：電泳緩沖液：TB

19、ETBE4.4.瓊脂糖瓊脂糖5.5.DNA Marker 5000DNA Marker 5000倒膠時把握好膠的溫度，不要高于倒膠時把握好膠的溫度，不要高于6060，否則溫度太高會使制板變形，否則溫度太高會使制板變形膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點樣孔膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點樣孔電泳前，確認(rèn)樣品孔位于電場負(fù)極；電泳前，確認(rèn)樣品孔位于電場負(fù)極；點樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多點樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多GelviewGelview有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔有毒，切勿用手接觸，更不要污

20、染環(huán)境，膠勿亂扔紫外線照射不要太久紫外線照射不要太久PCR常見問題o無擴(kuò)增產(chǎn)物o非特異性擴(kuò)增或拖尾o假陽性問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無M樣品樣品A 樣品樣品B 正對照正對照1.1.純度：含有抑制物純度：含有抑制物2.2.濃度：含量低濃度：含量低3.3.質(zhì)量：全長質(zhì)量：全長4.4.結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu) 原原因因?qū)Σ卟?.1.純化模板或者使用優(yōu)質(zhì)純化模板或者使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板試劑盒提取模板DNADNA2.2.加大模板的用量加大模板的用量3.3.用好的反轉(zhuǎn)錄酶用好的反轉(zhuǎn)錄酶4.4.用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶無擴(kuò)增產(chǎn)物之模板原因1.引物引物錯誤錯誤2.引物設(shè)計不好引物設(shè)計不好3.引物降解引物降解4.引物合成、純化不好引物合成、純化不好 原原因因?qū)Σ卟?.1.合成前檢查合成前檢查2.2.評價、重新設(shè)計引物評價、重新設(shè)計引物3.