人IL17AF定量檢測試劑盒ELISA說明書

1、僅供科研使用，不得用于臨床檢驗(yàn)。人IL-17AF定量檢測試劑盒（ELISA）說明書【貨 號(hào)】YKE-1434【產(chǎn)品名稱】通用名稱：人IL-17AF定量檢測試劑盒（ELISA）英文名稱： Human IL-17AF【包裝規(guī)格】96人份/盒【預(yù)期用途】僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17AF的濃度?！緳z驗(yàn)原理】本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗人IL-17AF單克隆抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生物素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-17AF與固相抗體和檢測抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的

2、鏈霉親和素(streptavidin-HRP)。洗滌后，加入顯色底物TMB，避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中IL-17AF的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長(參考波長570 -630 nm)測定吸光度值。【主要組成成分】主要成分組分規(guī)格數(shù)量包被微孔板96T1板標(biāo)準(zhǔn)品4000pg/mL2管抗體80uL1管 辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素150uL1管10×檢測緩沖液5mL1瓶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液5mL1瓶TMB顯色液10mL1瓶TMB終止液10mL1瓶洗滌緩沖液(20X)30ml1瓶封板膜4張注意：使用前請(qǐng)檢查試劑盒中試劑的標(biāo)簽和數(shù)量與表格是否一致【樣本要求】 樣本類型和采集

3、細(xì)胞培養(yǎng)上清 300 g 離心 10 分鐘去除沉淀物，即刻檢測, 或者分裝，-20以下貯存。血清樣本 分離管分離血清。在 1000 g 離心之前，使血樣凝集 30 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或 者分裝，-20以下貯存。 血漿樣本 EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。1000 g 離心 3 0 分鐘收集樣本。即刻檢測，或者 分裝，-20以下貯存。 本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過驗(yàn)證。 注意：檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。 樣本應(yīng)分裝并貯存于-20，以避免人IL-6活性的丟失。如果在 24 小時(shí)內(nèi)檢測，樣本可以 存放

4、在 2 - 8。 避免樣本的反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍樣本應(yīng)該緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻。樣本保存和穩(wěn)定性樣本在2-8條件下，可以儲(chǔ)存72h，或者在- 20儲(chǔ)存6個(gè)月。樣本收集后，不是一次檢測完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍?！緳z驗(yàn)方法】試劑準(zhǔn)備 檢測前請(qǐng)將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫。 如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。 1×洗液 吸取 20×濃縮洗液 30 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水或去離子水至600 ml，輕輕混勻，避免泡 沫。 轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 25貯存，1×洗液可穩(wěn)定 30 天

5、。1×檢測緩沖液 吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水或去離子水至 50 ml，輕輕混勻，避 免泡沫。 2 - 8貯存，1×檢測緩沖液可穩(wěn)定保存 30 天。 檢測抗體 稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢 測抗體。 注意：請(qǐng)?jiān)?30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的檢測抗體。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素 稀釋前充分混勻。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 鏈霉親和素。 注意：請(qǐng)?jiān)?30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的辣根

6、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。 樣本稀釋 如果樣本需要稀釋，請(qǐng)用試劑盒提供的 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋 細(xì)胞培養(yǎng)上清。人IL-17AF標(biāo)準(zhǔn)品 用蒸餾水或去離子水重溶人IL-17AF標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注在人IL-17AF標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔 地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為4000 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋 前充分混勻。 請(qǐng)使用聚丙烯管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 取 250 l 濃縮的人IL-17AF標(biāo)準(zhǔn)品，加入 250 l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度 (2000 pg/ml)。在

7、每一個(gè)試管中加入 250 l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移 液時(shí)，請(qǐng)確保充分混勻。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。 細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 取 250 l 濃縮的人IL-17AF標(biāo)準(zhǔn)品，加入 250 l 細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度 (2000 pg/ml)。在每一個(gè)試管中加入 250 l 細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液 時(shí)，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零【檢測步驟】 檢測之前請(qǐng)將所有的試劑、樣本平衡至室溫。 1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。2.將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，

8、重新封好封口。3.加入300 l1×洗液靜置浸泡30秒。為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請(qǐng)立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。4.復(fù)孔加入100 l2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓讖?fù)孔加入100 l標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。5. 樣本孔加入50 l1×檢測緩沖液和50 l樣本。6. 每孔加入50 l稀釋的檢測抗體。保證步驟4、5、6連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在15分鐘內(nèi)完成。7. 使用封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育2小時(shí)。8.棄掉液體，每孔加入300 l洗液洗板，洗滌6次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能，必須

9、徹底移除殘留液體。9.每孔加入100 l稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。10. 使用新的封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育45分鐘。11. 重復(fù)步驟8。12. 每孔加入100 l顯色底物TMB，避光，室溫孵育5 -30分鐘。13. 每孔加入100 l終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，充分混勻。14. 在30分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm或630 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測定值減去570 nm或630 nm的測定值。僅使用450 nm測定會(huì)導(dǎo)致OD值偏高，

10、并且準(zhǔn)確度降低。【結(jié)果計(jì)算】計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均OD值，然后減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w分析確定最佳擬合曲線。通過對(duì)濃度值和OD值取對(duì)數(shù)擬合，可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會(huì)降低一些。注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的終濃度為4000 pg/ml。如果完全按照說明書的步驟操作(50 l樣本+ 50l檢測緩沖液)，計(jì)算樣本濃度時(shí)請(qǐng)乘以稀釋因子2。如果樣本按照說明書進(jìn)行了稀釋，最終的稀釋倍數(shù)為2。如果樣本進(jìn)行了其它方式的稀釋，計(jì)算樣本濃度時(shí)請(qǐng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)?！緳z驗(yàn)方法的局限性】1

11、、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。5、如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測定。6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測結(jié)果，檢測前，請(qǐng)排除該因素。7、通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1、物理性能試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。2、劑量反應(yīng)曲線線性校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。3、精密度批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度

12、樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。4、檢測范圍62.50pg/ml4000pg/ml 5、靈敏度最低檢出劑量小于10.24pg/mL。6、回收率三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次回收率評(píng)估，回收率在85%-115%之間。7、特異性本試劑盒識(shí)別天然和重組人IL-17AF，與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。8、穩(wěn)定性 2-8保存，有效期6個(gè)月?！咀⒁馐马?xiàng)】生物安全1、檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。3、底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后徹底洗手。技術(shù)提示1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確