生物催化技術(shù)復(fù)習(xí)最終版

1、n 酶反應(yīng)器主要包括哪些種類?n Fed-batch：流加分批式發(fā)酵底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶（細(xì)胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。n 微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶所用培養(yǎng)基中有機(jī)氮源包括:玉米漿 蛋白胨酵母粉等.n 酶的提取方法：n 通過分析比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系, 可以把酶生物合成的模式分為4種類型。同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型Monod提出的在特定溫度、pH、營養(yǎng)物類型、營養(yǎng)物濃度等條件下，微生物的比生長速率與限制性營養(yǎng)物濃度之間存在的關(guān)系。圖1在培養(yǎng)過程中， 細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度成正比圖2假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不

2、存在其他生長限制因素時(shí)，為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。KS 為莫諾德常數(shù)， 是指比生長速率達(dá)到最大比生長速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。n 酶提取過程中細(xì)胞破碎方法包括：酶法物理化學(xué)破碎n 無載體固定化酶的方法有：交聯(lián)酶聚體 交聯(lián)酶晶體等n 培養(yǎng)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白酶的過程中使用的微生物反應(yīng)器 ? 空氣攪拌器n 超臨界流體萃取超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。n 酶非水相催化中有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系包括：水與有機(jī)溶劑的均一體系、水與不溶有機(jī)溶劑的非均一體系、微水體系反膠束體系正膠束體系微水體系反膠束體系正膠束體系等n 1961年國際酶

3、學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、異構(gòu)酶、裂合酶、連接酶n 酶的專一性包括：絕對(duì)專一、相對(duì)專一性n 固定化酶 通過物理或化學(xué)手段將酶束縛于水不溶載體上，或?qū)⒚甘`在一個(gè)有限的空間限制酶分子的自由流動(dòng)，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。n 酶分子修飾通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變某些特性和功能的技術(shù)。n 抗體酶 抗體酶又稱催化抗體（catalytic antibody），是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可

4、變區(qū)賦予了酶的屬性。n 酶的輔因子包括輔酶：與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔基：與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑：金屬離子作為輔助因子。n 酶的可逆性抑制劑分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種n 影響酶活性的主要因素有 PH、溫度、抑制劑、激活劑、底物濃度n 酶的生產(chǎn)方法包括提取分離、化學(xué)合成、生物合成n 固定化酶的方法包括包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法、吸附法、交聯(lián)法n 酶活力單位在特定條件下，每一分鐘催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量n 優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物具備的條件酶產(chǎn)量高、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好、容易培養(yǎng)和管理、利于酶的分離和純化、安全可靠無毒性。n 酶非水相催化的特點(diǎn)（1）增加非極

5、性基質(zhì)的溶解度；（2）使某些原本在水相不能進(jìn)行的反應(yīng)順利進(jìn)行，如肽的合成、酯的合成等；（3）可減少在水相容易發(fā)生的副反應(yīng)，如酸酐的水解、鹵化物的水解等；（4）容易分離回收；（5）無微生物污染。n 固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。 固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來的代謝途徑進(jìn)行新陳代謝，并進(jìn)行有效的代謝調(diào)節(jié)控制。 發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或者連續(xù)使用較長的一段時(shí)間。  固定化微生物細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率。  提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性。 n 酶分子修飾的原理及其修飾方法原理1、

6、修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。從而增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性。 2、大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。從而保護(hù)酶活性部位并起到低抗抑制劑和抗蛋白水解酶的作用。 3、酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。 4、酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除，“遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合。消除酶的抗原性，使酶穩(wěn)定。 5、大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部

7、位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。方法：表面化學(xué)修飾:大分子修飾、小分子修飾、交聯(lián)修飾、固定化修飾酶分子內(nèi)部修飾：蛋白主鏈修飾、氨基酸置換修飾、金屬離子置換修飾n 固定化酶的基本方法及其優(yōu)缺點(diǎn)吸附法(物理吸附法:酶活力損失少，但酶和載體的結(jié)合不穩(wěn)定，容易脫落。離子吸附法: 吸附法較為牢固，所以應(yīng)用比較廣泛。 包埋法：包埋法優(yōu)點(diǎn)在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但是又較牢固的固定化方法。包埋法的缺點(diǎn)是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對(duì)那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改變，使活力降低。共價(jià)結(jié)合（偶聯(lián)）法 （1）共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)

8、：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。 （2）共價(jià)偶聯(lián)法的缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響。 酶直接交聯(lián)法：操作簡單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。n 非水相催化的定義、種類及在有機(jī)介質(zhì)中催化的優(yōu)點(diǎn) 定義:酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用種類:有機(jī)介質(zhì)、氣相介質(zhì)、超臨界流體介質(zhì)、離子液介質(zhì)優(yōu)點(diǎn):1. 增加非極性基質(zhì)的溶解度2. 使某些原本在水相不能進(jìn)行的反應(yīng)順利進(jìn)行3. 可減少在水相容易發(fā)生的副反應(yīng)4. 容易分離回收5. 無微生物污染n 細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系, 可以把

9、酶生物合成的模式分為哪幾種類型？分別介紹這幾種類型. 同步合成型：大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成；延續(xù)合成型：酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時(shí)間；中期合成型：該類型的酶在細(xì)胞生長一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止；滯后合成型：此類型酶是在細(xì)胞生長一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，

10、阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。n 固定化細(xì)胞與固定化酶的區(qū)別n 酶的命名方法包括系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。慣用名：只取一個(gè)較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。n 酶與底物的結(jié)合模型可以分為鎖鑰關(guān)系和誘導(dǎo)鍥合學(xué)說n 酶非水相催化的種類包括有機(jī)介質(zhì)、氣相介質(zhì)、超臨界流體介質(zhì)、離子液介質(zhì)n 分子修飾的方法包括表面化學(xué)修飾:大分子修飾、小分子修飾、交聯(lián)修飾、固定化修飾酶分子內(nèi)部修飾：蛋白主鏈修飾、氨基酸置換修飾、金屬離子置換修飾n 酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法包括固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵n 常用產(chǎn)酶微生物包括細(xì)菌：大腸桿菌、醋酸桿菌、枯

11、草芽孢桿菌放線菌：鏈霉菌屬 、諾卡氏菌屬霉菌：黑曲霉、米曲霉、紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等n 培養(yǎng)基的5大要素包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、水n 實(shí)驗(yàn)室常用的微生物培養(yǎng)基細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基n 極端酶的定義及其制備方法定義:具有超常的生物學(xué)穩(wěn)定性,能夠在極端溫度,pH,壓力和離子強(qiáng)度下表現(xiàn)出生物學(xué)活性的,由極端微生物生產(chǎn)的酶類制備方法:(1). 天然極端酶的篩選和生產(chǎn) 從極端環(huán)境中篩選出能產(chǎn)極端酶的微生物,并模擬極端環(huán)境進(jìn)行生產(chǎn).存在的問題: 極端微生物生長緩慢,產(chǎn)酶量低,且模擬

12、極端環(huán)境成本高,難度大.(2). 蛋白質(zhì)工程利用基因工程技術(shù)將其極端酶基因克隆到普通宿主菌中,這樣就可以在溫和條件下生產(chǎn)極端酶了.存在的問題: 極端酶只有在極端環(huán)境中才能表現(xiàn)出高活性,但工程菌的生存環(huán)境與極端菌明顯不同,因此,表達(dá)后的酶蛋白是否能形成活性構(gòu)象是關(guān)鍵問題.n 酶反應(yīng)器的種類及如何選擇合適的酶反應(yīng)器1、根據(jù)適用的反應(yīng)條件選擇酶反應(yīng)器。游離酶催化反應(yīng)最常用的反應(yīng)器是拌罐式反應(yīng)器。 對(duì)于有氣體參與的酶催化反應(yīng)，通常采用鼓泡式反應(yīng)器。 對(duì)于某些價(jià)格較高的酶，由于游離酶與反應(yīng)產(chǎn)物混在一起，為了使酶能夠回收，可以采用游離酶膜反應(yīng)器。對(duì)于某些耐高溫的酶，如高溫淀粉酶等，可以采用噴射式反應(yīng)器，進(jìn)

13、行連續(xù)式的高溫短時(shí)反應(yīng)。 2、根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)選擇反應(yīng)器：(1)必須保證酶分子與底物分子能夠有效碰撞，為此，必須使酶與底物在反應(yīng)系統(tǒng)中混合均勻。攪拌罐式反應(yīng)器、流化床式反應(yīng)器均具有較好的混合效果。填充床式反應(yīng)器的混合效果較差。在使用膜反應(yīng)器時(shí)，也可以采用輔助攪拌或者其他方法，以提高混合效果，防止?jié)獠顦O化。(2)底物濃度的高低對(duì)酶反應(yīng)速度有顯著影響。具有高濃度底物抑制作用的酶，如果采用分批攪拌罐式反應(yīng)器，可以采取流加分批反應(yīng)的方式進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于具有高濃度底物抑制作用的游離酶，可以采用游離酶膜反應(yīng)器進(jìn)行催化反應(yīng)；對(duì)于具有高濃度底物抑制作用的固定化酶，可以采用連續(xù)攪拌罐式反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器、

14、流化床式反應(yīng)器、膜反應(yīng)器等進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)。(3)有些酶催化反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酶有反饋抑制作用。對(duì)于具有產(chǎn)物反饋抑制作用的固定化酶，也可以采用填充床式反應(yīng)器。(4)某些酶可以耐受100以上的高溫，最好選用噴射式反應(yīng)器。3、根據(jù)底物或產(chǎn)物的理化性質(zhì)選擇反應(yīng)器：(1)反應(yīng)底物或產(chǎn)物的分子質(zhì)量較大時(shí)，由于底物或產(chǎn)物難于透過超濾膜的膜孔，所以一般不采用膜反應(yīng)器。(2)反應(yīng)底物或者產(chǎn)物的溶解度較低、粘度較高時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇攪拌罐式反應(yīng)器或者流化床式反應(yīng)器，而不采用填充床式反應(yīng)器和膜反應(yīng)器，以免造成阻塞現(xiàn)象。(3)、反應(yīng)底物為氣體時(shí)，通常選擇鼓泡式反應(yīng)器。(4)、有些需要小分子物質(zhì)作為輔酶（輔酶可以看作是一種

15、底物）的酶催化反應(yīng)，通常不采用膜反應(yīng)器，以免輔酶的流失而影響催化反應(yīng)的進(jìn)行。n 工業(yè)生物技術(shù)：在工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)過程中使用或部分使用生物技術(shù)來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的制造，這種技術(shù)是應(yīng)用微生物和生物催化劑來提供產(chǎn)品和服務(wù).n 鹽析： 是利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀.n 生物催化： 利用酶或有機(jī)體（細(xì)胞或細(xì)胞器等）作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。n 極端酶： 具有超常的生物學(xué)穩(wěn)定性,能夠在極端溫度,pH,壓力和離子強(qiáng)度下表現(xiàn)出生物學(xué)活性的,由極端微生物生產(chǎn)的酶類。n 酶的定向進(jìn)化:人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。n 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué):研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。n 酶的非水相催化: 在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用稱為酶的非水相催化。n 吸附層析中洗脫劑的選擇要注意的問題包括:洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，也不會(huì)使吸附劑溶解。洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的