第14章高效液相色譜

1、第第1414章章 高效液相色譜高效液相色譜High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography(HPLC)(HPLC)14.1 概述概述14.2 HPLC儀器儀器 包括：高壓輸液裝置；進(jìn)樣系統(tǒng)；包括：高壓輸液裝置；進(jìn)樣系統(tǒng)； 分離系統(tǒng)；分離系統(tǒng)； 檢測(cè)系統(tǒng)；輔助系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)；輔助系統(tǒng)。14.3 流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介14.4 高效液相色譜方法各論高效液相色譜方法各論 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排 阻色譜和親和色譜阻色譜和親和色譜

2、14.1 概述概述 高效液相色譜是以液體為流動(dòng)相的色譜方法。高效液相色譜是以液體為流動(dòng)相的色譜方法。 按照固定相不同分為：按照固定相不同分為：液液分配色譜；液固吸附色液液分配色譜；液固吸附色譜；離子交換色譜；尺寸排阻色譜譜；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜)。 此外，還有親和色譜、平板色譜此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜薄層色譜)等。等。 早期液相色譜，包括早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑的工作，都是在直徑15cm, 長(zhǎng)長(zhǎng)50500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在的固定相顆

3、粒直徑多在150200 m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低然很低(7時(shí)，該檢測(cè)時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。器不夠靈敏。 其它檢測(cè)器還包括：其它檢測(cè)器還包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射光散射)、極譜等。、極譜等。14.3 HPLC流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介一、流動(dòng)相一、流動(dòng)相 與與GC流動(dòng)相不同，流動(dòng)相不同，HPLC流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，又和固定相一樣，參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此溶劑的選擇對(duì)分離又和固定相一樣，參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此溶劑的選擇對(duì)分離十分重要。理想的溶劑應(yīng)

4、有下列特性：十分重要。理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；2）使用）使用UV檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長(zhǎng)要小于測(cè)量波長(zhǎng)檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長(zhǎng)要小于測(cè)量波長(zhǎng)(為什為什么？么？) ；使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率；使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率有較大差別；有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)使截止波長(zhǎng)增加；）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)使截止波長(zhǎng)增加；4）化學(xué)穩(wěn)定性好；）化學(xué)穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過(guò)高，柱壓增加；過(guò)低，易產(chǎn)生氣泡。）適宜的粘度。粘度過(guò)高，柱壓增加；過(guò)低，易產(chǎn)生氣泡。1.

5、按承受壓力分按承受壓力分剛性固體：剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為為基質(zhì)，耐壓為7.01081.0109 Pa?？芍瞥芍睆健⑿螤??？芍瞥芍睆健⑿螤?和孔隙深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；和孔隙深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；硬硬 膠：膠：以聚合物為基質(zhì)以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為，耐壓上限為 3.5108 Pa, 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。2. 按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型：表面多孔型：以實(shí)心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料以實(shí)心玻璃珠為基體，在基體表面

6、覆蓋一層多孔活性材料(如如 硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔。表面多孔 型固定相的顆粒大型固定相的顆粒大(易裝柱易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，滲透性好， 出峰快出峰快)；但交換容量小。適于常規(guī)分離分析。；但交換容量小。適于常規(guī)分離分析。全多孔型：全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細(xì)，因而孔徑小、全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細(xì)，因而孔徑小、 傳質(zhì)快、傳質(zhì)快、 柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。二、固定相載體二、固定相載體 由于各種由于各種HP

7、LC分離方法的流動(dòng)相均為液體，因此，分離方法的流動(dòng)相均為液體，因此，HPLC通常是按照固定相載體或固定液的不同來(lái)分類(lèi)的。通常是按照固定相載體或固定液的不同來(lái)分類(lèi)的。14.4 高效液相色譜方法各論高效液相色譜方法各論 一、分配色譜一、分配色譜 1. 原理：原理： 根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶劑中的溶解度不同，因而具不同的分配根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶劑中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程

8、。2. 流動(dòng)相流動(dòng)相: HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為程度，可將液液色譜分為正相分配色譜正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。定相極性，極性大的先流出

9、，適于非極性組分分離）。3. 固定相固定相 原則上用于原則上用于GC的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC作固定相。但作固定相。但HPLC固定液易固定液易流失，因此常用的只有幾種，極性由高到低為：流失，因此常用的只有幾種，極性由高到低為： , -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇聚乙二醇(PEG)、三甲撐二醇、三甲撐二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、角鯊?fù)?、角鯊?fù)?SQ)。 根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。者應(yīng)用更為廣泛。1）機(jī)械涂漬固定相：）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過(guò)機(jī)械混

10、合的方法涂漬到表面多孔型將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型載體或全多孔型載體(5-10%涂布量涂布量)上形成的液液色譜固定相上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。合梯度淋洗。 為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定

11、液飽和。定液飽和。2）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。 通常，化學(xué)鍵合相的載

12、體主要是硅膠（表面有硅醇基）：通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在應(yīng)在4-8之間。之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。HClSiROSiSROHS

13、iRSiClSiOHSiROSiOHROHSiSOClSOCl 33RMgClRLiiCl22方方法法三三（硅硅烷烷化化）方方法法二二（酰酰氯氯化化）方方法法一一（硅硅酯酯化化）或或3）. 正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法 在在HPLC分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽(碳酸銨、四碳酸銨、四烷基銨鹽烷基銨鹽)或酸，為什么？或酸，為什么？固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動(dòng)相極性大流動(dòng)相極性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對(duì)象分

14、析對(duì)象 多用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物分離；改變流動(dòng)相配比，動(dòng)相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如有機(jī)解的化合物，如有機(jī)有機(jī)酸、有機(jī)酸、有有機(jī)機(jī)堿和酚堿和酚類(lèi)類(lèi)。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小小 烴類(lèi)烴類(lèi)+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對(duì)象分析對(duì)象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離異構(gòu)體、異構(gòu)

15、體、極性不同的化合物以及不同類(lèi)型的化合物。極性不同的化合物以及不同類(lèi)型的化合物。 答：都是為防止峰形拖尾。加入鹽類(lèi)是為了減少待測(cè)物與鍵合相表答：都是為防止峰形拖尾。加入鹽類(lèi)是為了減少待測(cè)物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類(lèi)待測(cè)物的離解，使其以游面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類(lèi)待測(cè)物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。離酸在柱內(nèi)分離。 何為正相色譜，何為反相色譜？何為正相色譜，何為反相色譜？正相色譜正相色譜低極性流動(dòng)相低極性流動(dòng)相反相色譜反相色譜高極性流動(dòng)相高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：待測(cè)物極性：AB

16、C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系時(shí)間，時(shí)間，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅膠硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可見(jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好?？梢?jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。 將離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各將離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類(lèi)陰、陽(yáng)離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，類(lèi)陰、陽(yáng)

17、離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1. 原理：原理：利用不同離子對(duì)固定相的親和能力（離子交利用不同離子對(duì)固定相的親和能力（離子交換能力）的差別實(shí)現(xiàn)分離。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂換能力）的差別實(shí)現(xiàn)分離。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：固定相上帶電荷基團(tuán)或游離離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：二、離子交換色譜二、離子交換色譜 ClXNRRXClNRR-:HMSORMHSOR-:33-3-3陰離子交換陽(yáng)離子交換 對(duì)陽(yáng)離子，滯留順序?yàn)椋簩?duì)陽(yáng)離子，滯留順序?yàn)椋?Fe3+, Ba2+, Pb2

18、+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 對(duì)陰離子，滯留順序?yàn)椋簷幟仕岣鶎?duì)陰離子，滯留順序?yàn)椋簷幟仕岣? SO42-, C2O42-, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待測(cè)陽(yáng)離子電荷越小、其水合離子的半徑越大，思考：待測(cè)陽(yáng)離子電荷越小、其水合離子的半徑越大，則越先出峰？對(duì)嗎？則越先出峰？對(duì)嗎？2. 固定相固定相按離子交換劑類(lèi)型分四種：

19、按離子交換劑類(lèi)型分四種： 按固定相制作方法可分為：按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹(shù)脂多孔型離子交換樹(shù)脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂；包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂； 離子交換鍵合型。離子交換鍵合型。 類(lèi)型類(lèi)型 官官能能團(tuán)團(tuán) 強(qiáng)強(qiáng)陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 -SO3- 陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 弱弱陽(yáng)陽(yáng)離離子子交換交換劑劑 -CO2- 強(qiáng)強(qiáng)陰陰離離子子交換交換劑劑 -NR3+ 陰陰離離子子交換交換劑劑 弱弱陰陰離離子子交換交換劑劑 -NH2+ 1）多孔型：）多孔型：聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)

20、聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)多多交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型離子交換層離子交換層惰性核惰性核惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅膠層涂覆2）表面多孔型：）表面多孔型：薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+樹(shù)脂薄層樹(shù)脂薄層(1-2 m);多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅膠微球硅膠微球+樹(shù)脂薄層?？朔硕嗫仔碗x樹(shù)脂薄層?？朔硕嗫仔碗x子交換樹(shù)脂的不足，但交換容量低，子交換樹(shù)脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。柱子易超負(fù)荷。3）離子交換鍵合相

21、：）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子3. 流動(dòng)相流動(dòng)相 離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類(lèi)緩沖溶液離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類(lèi)緩沖溶液(有一定有一定pH和離子強(qiáng)度和離子強(qiáng)度) ，通過(guò)改變，通過(guò)改變pH、緩沖劑類(lèi)型、離子強(qiáng)度、緩沖劑類(lèi)型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比k，改變交，改變交換劑的選擇性，

22、進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。pH值：值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度I：對(duì)保留值的影響比對(duì)保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動(dòng)相更大。組分保留值受流動(dòng)相中鹽類(lèi)總濃度控制。增加外加陰或陽(yáng)離子將增加它們對(duì)中鹽類(lèi)總濃度控制。增加外加陰或陽(yáng)離子將增加它們

23、對(duì)R+或或R-的競(jìng)爭(zhēng)能力，使組分保留值減小。加入不同種類(lèi)的鹽，的競(jìng)爭(zhēng)能力，使組分保留值減小。加入不同種類(lèi)的鹽，可影響柱的選擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同?？捎绊懼倪x擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同。有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。雜環(huán)已烷等。配離子配離子L：當(dāng)大量當(dāng)大量L、組分、組分X隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：交換： RM-L+X RM-X+L該法用

24、于分離各種氨基酸或堿類(lèi)。該法用于分離各種氨基酸或堿類(lèi)。思考：離子交換色譜法中，流動(dòng)相常以無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)思考：離子交換色譜法中，流動(dòng)相常以無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相。請(qǐng)問(wèn)緩沖液的相。請(qǐng)問(wèn)緩沖液的pH值及離子強(qiáng)度對(duì)分離各有何影響？值及離子強(qiáng)度對(duì)分離各有何影響？三、離子色譜三、離子色譜 離子色譜離子色譜(IC)是是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離子約高待測(cè)離子約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，

25、這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。測(cè)離子信號(hào)。 為解決此問(wèn)題，為解決此問(wèn)題，1975年年Small提出，在離子交換柱之提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。例如：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為例如

26、：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+OH + HCl(流動(dòng)相流動(dòng)相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待測(cè)物待測(cè)物) R+Cl + M+OH-可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。 該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。因此有人提出在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。因此有人提出使用電導(dǎo)率很低的溶液使用電

27、導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液如苯甲酸鹽稀溶液)作流動(dòng)相。作流動(dòng)相。思考：思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子時(shí)，抑制分離中，何為抑制柱？分析陰離子時(shí)，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹(shù)脂？柱中應(yīng)填充何種離子交換樹(shù)脂？四、離子對(duì)色譜法（四、離子對(duì)色譜法（IPC） 離子對(duì)色譜主要用來(lái)分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。離子對(duì)色譜主要用來(lái)分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。 有機(jī)相水相水相BABA1. 原理：原理：將與待測(cè)物離子將與待測(cè)物離子A、電荷相反的離子、電荷相反的離子B（稱(chēng)（稱(chēng)為對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與為對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與對(duì)離子形成離子對(duì)對(duì)離子形成離子對(duì)AB，該，

28、該AB離子對(duì)離子對(duì)與與A離子離子或或B離子離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于流動(dòng)相中加入與待測(cè)離子流動(dòng)相中加入與待測(cè)離子A-有相反電荷的離子有相反電荷的離子B+：思考：有一強(qiáng)極性有機(jī)酸混合物，若用離子對(duì)色譜法思考：有一強(qiáng)極性有機(jī)酸混合物，若用離子對(duì)色譜法分離，請(qǐng)問(wèn)在流動(dòng)相中應(yīng)加入陰離子還是陽(yáng)離子來(lái)形分離，請(qǐng)問(wèn)在流動(dòng)相中應(yīng)加入陰離子還是陽(yáng)離子來(lái)形成離子對(duì)？成離子對(duì)？ 由于離子對(duì)由于離子對(duì)AB具有疏水性，因而被非極性固定相具有疏水性，因而被非極性固定

29、相提取。其它待測(cè)離子提取。其它待測(cè)離子A1，A2，A3.因與因與B離子間的離子間的成對(duì)能力不同，而形成不同疏水性的離子對(duì)，使得各成對(duì)能力不同，而形成不同疏水性的離子對(duì)，使得各待測(cè)物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達(dá)到分離的目的。待測(cè)物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達(dá)到分離的目的。五、尺寸排阻色譜法五、尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜又稱(chēng)凝膠尺寸排阻色譜又稱(chēng)凝膠(滲透滲透)色譜，主要用于大色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀分子的分子分離。它是基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。1. 分離原理：分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類(lèi)固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔穴中而被排阻，較早分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大小最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大小(分子量大分子量大小小)先后從柱中流出。先后從柱中流出。類(lèi)型類(lèi)型 材料材料 型號(hào)型號(hào) 特點(diǎn)特點(diǎn) 流動(dòng)相流動(dòng)相 葡萄糖凝膠葡萄糖凝膠 Sephadax 水水 軟性凝膠軟性凝膠 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶脹溶