電化學發(fā)光免疫分析法

1、電化學發(fā)光免疫分析法Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI ) w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法免疫分析w 基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段；w 免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。免疫學檢測歷史演進w 放射免疫檢測（興起于20世紀70年代，現仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院）；w 酶聯免疫檢測（興起于20世紀80年代，各臨床機構普遍使用）；w 以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢

2、測技術（20世紀90年代開始推廣使用，產品步入成長期）三個階段。w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法發(fā)光現象螢火蟲發(fā)光深海魚發(fā)光發(fā)光分類w 光照發(fā)光:發(fā)光劑經短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。w生物發(fā)光：反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。w化學發(fā)光化學發(fā)光化學發(fā)光Chemiluminescence (CL) w 化學發(fā)光是指在某些特殊的化學反應中，反應的中間體或產物由于吸收了反應釋放的化學能而處于電子激發(fā)態(tài)，當其回到基態(tài)時伴隨產生的光輻射現象

3、。 化學發(fā)光反應包括兩個關鍵步驟，即化學激發(fā)和發(fā)光?；瘜W發(fā)光反應能級圖化學發(fā)光分析w 根據化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度或反應的發(fā)光總量來確定反應中相應組分含量的分析方法，稱為化學發(fā)光分析?；瘜W發(fā)光分析優(yōu)點w 化學發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，w 并且不象放射分析那樣存在強烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法?；瘜W發(fā)光分析缺點w 雖然化學發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法化學發(fā)光免疫分析

4、chemiluminescence immunoassay（ CLIA）w CLIA是將化學發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。w 這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應的高度特異性。 化學發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類w 按分離方法不同分n微粒子化學發(fā)光免疫測定n磁顆粒化學發(fā)光免疫測定化學發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類w 按發(fā)光劑不同分為n發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ）n化學發(fā)光免疫測定技術 （chemiluminescence immunoassay， CLIA ）n電化學發(fā)光免疫測定技術

5、（electrochemiluminescence immunoassay， ECLI ）w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法電致化學發(fā)光（ECL)w 電致化學發(fā)光 (ECL) 是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號進行電解反應的產物之間或與體系中共存組分反應產生化學發(fā)光的現象。電致化學發(fā)光（ECL)w ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發(fā)光反應，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。因此ECL反應易精確控制，具有靈活性。電化學發(fā)光劑w 定義：指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質。w 特點n反應在電極進行n化學發(fā)光劑：三聯毗啶釕n電子供

6、體為：三丙胺（TPA）三聯毗啶釕分子結構圖NNNNNNRuOONOO三聯吡啶釕（ Ru(bpy)32+ ）特點w ECL分析中采用Ru(bpy)32+作為標記物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羥基琥珀酸胺酯（NHS） ，該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學發(fā)光反應的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯吡啶釕（ Ru(bpy)32+ ）特點w Ru(bpy)32+衍生物與免疫球蛋白結合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性；w Ru(bpy)32+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標記，使檢測的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測菜單的開發(fā)前景提供了廣闊空間。電

7、化學發(fā)光原理圖TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光 子(620nm)333*基態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法電化學發(fā)光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)w ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時間分辨熒光免疫技術（TRFIA）之后的新一代標記免疫測定技術； w ECLI是電化學發(fā)光(ECL)和免疫測定相結合的產物；w ECLI是目前最先進的標記免疫測定技術之一。 ECLI原理w 在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，用電化學發(fā)光劑

8、三聯吡啶釕Ru(bpy)32+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結合）ECLIA體系結構圖ECLIA檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學反應）ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）方法評價w 采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特點是反應面積比板式擴大2030倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應時類似液相，反應速度大大加快；方法評價w “鏈霉親和素-生物素”是是具有很強的非共價相互作用的一對化合物，具有牢固而特異的結合，應用此放大系統，使檢測的靈敏度大大提高；方法評價w 利用氧化鐵的磁性，使用電磁場分離結合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實現了精確的全自動化；w 標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定。ELIA優(yōu)越性w 高度敏感，可達pgml或pmol水平；w 特異性強，重復性好，CV5。w 測定范圍寬，可達7個數量級。w 試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，