2019生物競(jìng)賽-生物化學(xué)-07核酸的性質(zhì)及研究方法-楊榮武《生物化學(xué)原理（一）》(21張)ppt課件

1、生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武提要提要一、核酸的理化性質(zhì)一、核酸的理化性質(zhì)二、核酸研討的技術(shù)和方法二、核酸研討的技術(shù)和方法 核酸的化學(xué)合成核酸的化學(xué)合成 核酸的分別、純化和定量核酸的分別、純化和定量 三、核酸一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定三、核酸一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定DNADNA一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定RNARNA一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定 生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)n紫外吸收n酸堿解離n變性n復(fù)性和雜交DNA的變性和復(fù)性的變

2、性和復(fù)性生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武變性變性定義：是指核酸遭到加熱、極端的pH或離子強(qiáng)度降低等要素或特殊的化學(xué)試劑的作用，其雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈的過(guò)程。其中并不涉及共價(jià)鍵斷裂。表征：核酸在變性時(shí)，紫外吸收和浮力密度升高，黏度降低，生物活性主要是RNA不變、降低或喪失，其中紫外吸收添加的景象稱為增色效應(yīng)。Tm：雙鏈DNA熱變性是在很窄的溫度內(nèi)發(fā)生的，與晶體在熔點(diǎn)時(shí)忽然熔化的情形類似，因此DNA也具有“熔點(diǎn)，用Tm表示。Tm實(shí)踐是DNA的雙螺旋有一半發(fā)生熱變性時(shí)相應(yīng)的溫度。DNA的Tm值遭到DNA的均一性、G-C含量、離子強(qiáng)度和特殊的化學(xué)試劑的影響。生物競(jìng)賽-生物

3、化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武GC含量對(duì)含量對(duì)DNA Tm的影響的影響生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武DNA分子中的分子中的GC含量與含量與DNA Tm之間的關(guān)系曲線之間的關(guān)系曲線生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武核酸變性在一定條件下也是可逆的。當(dāng)各種變性要素不復(fù)存在的時(shí)候，變性時(shí)解開的互補(bǔ)單鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋構(gòu)造的景象稱為復(fù)性。熱變性DNA 普通經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程被稱為退火。伴隨著DNA復(fù)性的是其浮力密度和紫外吸收的減少、粘度的添加和生物活性的恢復(fù)，其中紫外吸收減少的景象被稱為減色效應(yīng)。影響DNA復(fù)性的要素有溫度、離子強(qiáng)

4、度、DNA濃度和DNA序列的復(fù)雜度等。復(fù)性復(fù)性生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武DNA的復(fù)性歷程的復(fù)性歷程生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武不同不同DNA的復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線的復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武核酸的水解核酸的水解1 1酸水解酸水解 核酸分子內(nèi)的糖苷鍵和磷酸二酯鍵對(duì)酸的敏感性不核酸分子內(nèi)的糖苷鍵和磷酸二酯鍵對(duì)酸的敏感性不同：糖苷鍵磷酸酯鍵；而嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷同：糖苷鍵磷酸酯鍵；而嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷鍵鍵2 2堿水解堿水解 RNA RNA的磷酸二酯鍵對(duì)堿異常敏感，得到的磷酸二酯鍵對(duì)堿異常敏感，得到2-2-或或3

5、-3-核苷酸的混合物；核苷酸的混合物；DNADNA對(duì)堿的作用并不敏感，其對(duì)堿的作用并不敏感，其抗堿水解的生理意義在于作為遺傳物質(zhì)的抗堿水解的生理意義在于作為遺傳物質(zhì)的DNADNA應(yīng)更穩(wěn)應(yīng)更穩(wěn)定，不易水解。而定，不易水解。而RNARNA主要是主要是mRNAmRNA是是DNADNA的信使的信使，完成義務(wù)后應(yīng)該迅速降解。，完成義務(wù)后應(yīng)該迅速降解。3 3酶促水解酶促水解生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武不同性質(zhì)的核酸酶不同性質(zhì)的核酸酶Pu表示嘌呤，表示嘌呤，Py表示嘧啶表示嘧啶 生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武核酸的分別、純化和定量核酸的分別、純化和定量 核酸

6、的抽取 兩種核蛋白的分別 蛋白質(zhì)的去除 核酸的沉淀 電泳 離心 層析 核酸的純度的檢測(cè)和定量 生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武DNA一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定一級(jí)構(gòu)造的測(cè)定nSanger發(fā)明的末端終止法或雙脫氧法nMaxam和Gilbert 發(fā)明的化學(xué)斷裂法n焦磷酸測(cè)序與深度測(cè)序生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武末端終止法末端終止法原理：ddNTP參入可導(dǎo)致DNA復(fù)制的末端終止步驟：進(jìn)展四組平行反響每一組反響混合物含有四種ddNTP每一組反響含有一種少量的ddNTP在多數(shù)情況下，聚合酶運(yùn)用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸有時(shí)，聚合酶運(yùn)用ddNTP，而導(dǎo)致末端終止每

7、一組反響中ddNTP的隨機(jī)插入留下一系列長(zhǎng)度不等的以該雙脫氧核苷酸結(jié)尾的DNA鏈。對(duì)每一組反響混合物走凝膠電泳片段越短，走的越快，就越接近凝膠的底部從凝膠的底部向上讀出序列將讀出的序列轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)鏈的序列生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武末端終止法圖解末端終止法圖解DNA自動(dòng)分析儀的組成自動(dòng)分析儀的組成生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武原理：是用特殊的化學(xué)試劑，處置待測(cè)的具有末端放射性同位素32P標(biāo)志的單鏈DNA或者只需一條鏈的末端被放射性同位素標(biāo)志的雙鏈DNA片段，呵斥特定堿基的修飾、零落和戊糖-磷酸骨架被特異性切割，從而產(chǎn)生一組長(zhǎng)度不同的DNA鏈降解產(chǎn)

8、物，經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分別和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。步驟：進(jìn)展四組平行的反響G特異性剪切 在堿性條件下，先用硫酸二甲酯 DMS 處置，然后再運(yùn)用哌啶處置。嘌呤堿基特異性剪切DNA先進(jìn)展酸處置，然后再加DMS。嘧啶堿基特異性剪切先用肼處置，然后用哌啶處置。C特異性剪切在高鹽下，先用肼處置，然后用哌啶處置。進(jìn)展聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影。比較G、AG、CT和C各個(gè)泳道，自下而上從自顯影片上就可讀出DNA序列?；瘜W(xué)斷裂法化學(xué)斷裂法生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武化學(xué)斷裂法測(cè)定化學(xué)斷裂法測(cè)定DNA一級(jí)構(gòu)造的原理一級(jí)構(gòu)造的原理 生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理

9、（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序需求在同一反響體系中發(fā)生由4種特異性酶催化的級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反響，在每一輪測(cè)序反響中，只參與一種dNTP，假設(shè)該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈的3端并釋放出等量PPi。PPi可轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并最終轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反響中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第一輪反響終了后，再參與下一種dNTP，繼續(xù)下一輪DNA鏈的合成。生物競(jìng)賽-生物化學(xué)原理（結(jié)構(gòu)生物化學(xué)）-南京大學(xué)楊榮武深度測(cè)序深度測(cè)序 除了焦磷酸測(cè)序法，近幾年來(lái)，科學(xué)家還發(fā)明了一些新的測(cè)序方法，例如單分子測(cè)序法single-molecule sequencing。建立在這些新的測(cè)序方法根底之上的高通量測(cè)序技術(shù)堪稱測(cè)序技術(shù)開展歷程的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子同時(shí)進(jìn)展測(cè)序，操作極為簡(jiǎn)便，大大節(jié)約了本錢和時(shí)間。這使得對(duì)一個(gè)物種基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)展細(xì)致全面的分析成為能夠，因此也稱其為深度測(cè)序deep sequencin