分子生物學與生物化學實驗操作設(shè)計與技能(9)

1、分子生物學與生物化學實驗分子生物學與生物化學實驗操作、設(shè)計與技能操作、設(shè)計與技能印跡技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)李 剛 副教授Northern Blot2Southern Blot1Western Blot3 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）4Southern Blot原理與用途 原理：將待檢測的DNADNA分子用分子用/ /不用限制性內(nèi)切酶不用限制性內(nèi)切酶消化消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記同位素或其它標記物標記的物標記的DNADNA或或RNARNA探針進行反

2、應(yīng)探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 用途：檢測樣品中的檢測樣品中的DNADNA及其含量，了解基因的狀及其含量，了解基因的狀態(tài)態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。 Southern Blot 操作步驟DNA 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交（變性探針）雜交（變性探針） 洗膜洗膜 放射自顯影或顯色放射自顯影或顯色。Southern BlotSouthern Blot操作步驟：操作步驟：轉(zhuǎn)膜方法毛細管轉(zhuǎn)移法毛細管轉(zhuǎn)

3、移法（向上、向下）：DNA 片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于固相支持物表面。液體通過毛細管作用抽吸過凝膠,借助于一疊干燥的吸水紙巾產(chǎn)生并維持毛細管作用。轉(zhuǎn)移的速率取決于DNA片段的大小和凝膠中的瓊脂糖的濃度，小片段小片段DNADNA（1kb400 bp50bp50bp固定固定真空條件下80C烘烤2h 70C烘烤1h,無需真空條件；真空條件下80C烘烤2h70C烘烤1h,無需真空條件；或者溫和的堿性條件或者254nm紫外照射；潮濕的膜暴露于1.6kJ/m2; 干燥的膜暴露于160kJ/ m2商業(yè)產(chǎn)品商業(yè)產(chǎn)品HybondNGeneScreenHybond-N+；Zeta-Probe；Nytran

4、+；Gene-Screen Plus 轉(zhuǎn)膜過程示意圖探針標記技術(shù) 1 標記物：放射性放射性和非放射性非放射性兩種 放射性：3232P P，35S。 非放射性：生物素生物素、地高辛地高辛、熒光素。 2、標記方法 （1）切口平移法 ：最經(jīng)典。 （2 2）隨機引物法：最常用。）隨機引物法：最常用。 （3）末端標記法。 （4）單鏈DNA探針標記。 （5）寡核苷酸探針標記法。 放射性探針的標記方法 1、切口平移法：目前已經(jīng)很少使用。 2、隨機引物法：DNA聚合酶可沿單鏈模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列是隨機的寡核苷酸的序列是隨機的，它們就可在模板的多位點上與模板雜交。因此模板上每一核苷酸的互補物

5、將以同樣的頻率摻入產(chǎn)物。用一種用一種 3232P P標記的標記的dNTPdNTP及其他三種非標記及其他三種非標記dNTPdNTP作為前體作為前體合成標記合成標記DNADNA, 可產(chǎn)生比活為5108-5 109dpm/g的探針。 Southern Blot操作要點 一般Southern雜交每一個電泳通道需要每一個電泳通道需要10-30g10-30g的的DNADNA。 為保證消化完全消化完全，一般用2-4U的酶消化1g 的DNA。消化的消化的DNADNA濃度不宜太高，以濃度不宜太高，以0.5g /l 0.5g /l 為好為好，加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過1/10，DNA樣品一定要消化完全。如果需要

6、兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。 標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于由于 - -3232P P的半的半衰期只有衰期只有1414天，所以標記好的探針應(yīng)盡快使用天，所以標記好的探針應(yīng)盡快使用。探針的比活性最好大于109計數(shù)/分/l。 鮭魚精鮭魚精DNADNA的作用是封閉的作用是封閉NCNC膜上沒有膜上沒有DNADNA轉(zhuǎn)移的位點，降低雜交轉(zhuǎn)移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。背景、提高雜交特異性。Southern Blot操作要點 在

7、洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背當放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背景高景高1-21-2倍時，是洗膜的終止點。倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。 根據(jù)信號強弱決定曝光時間，一般在曝光時間，一般在1-31-3天時間。天時間。洗片時，先洗一張先洗一張X X光片光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子再洗第二張片子。 影響影響SouthernSouthern雜交實驗的因素很多雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點等。 Southern

8、Blot注意事項 1. 要取得好的轉(zhuǎn)移和雜交效果，應(yīng)根據(jù)DNA 分子的大小，適當調(diào)整變性時間。對于分子量較大的對于分子量較大的DNADNA片段（大于片段（大于15kb15kb），），可在變性前用可在變性前用0.2M HCl0.2M HCl預(yù)處理預(yù)處理10 min 10 min 使其脫嘌呤。使其脫嘌呤。 2. 轉(zhuǎn)移用的膜要預(yù)先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會影響轉(zhuǎn)移用的膜要預(yù)先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會影響轉(zhuǎn)膜效果；不可用手觸摸膜轉(zhuǎn)膜效果；不可用手觸摸膜，否則影響DNA的轉(zhuǎn)移及與膜的結(jié)合。 3. 轉(zhuǎn)移時，注意膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果。 4. 注

9、意同位素的安全同位素的安全使用。 5.進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。期，安全性好。Southern Blot常見問題分析 1、DNA太少太少，雜交的敏感度不夠高； 2、DNA太多太多，酶切不完全，雜交條帶不完全； 3、使用太高電壓電泳太高電壓電泳：膠熔化或電泳條帶沒有完全 分開； 4、預(yù)雜交時封閉不完全封閉不完全：背景高，出現(xiàn)無法解釋的 結(jié)果； 5、洗膜不充分洗膜不充分：背景高，出現(xiàn)無法解釋的結(jié)果； 6、過度洗膜過度洗膜：特異性結(jié)合的核酸條帶被洗掉；一

10、張同位素放射自顯影的一張同位素放射自顯影的Southern blotSouthern blot照片照片 一張地高辛顯色的一張地高辛顯色的Southern blotSouthern blot照片照片Southern blot操作視頻操作視頻Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNARNA樣品樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同同Southern BlotSouthern Blot相同的原理相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNAmRNA）及其含）及其含量。量。 Northern Blot操作過程R

11、NARNA提取提取 甲醛變性電泳甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學發(fā)光Northern blot操作注意事項 1.基本注意事項和Southern blot相似; 2.獲得高質(zhì)量的獲得高質(zhì)量的RNARNA是做好Northern blot的 關(guān)鍵; 3.操作過程要小心、仔細，防止防止RNARNA樣品的降樣品的降 解解。Northern blot操作視頻操作視頻Western Blot 原理原理： 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應(yīng)，洗滌去除

12、沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等顯色或發(fā)光等，觀察有無有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量半定量。 Western blot操作過程 SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜（PVDFPVDF或硝酸纖維素膜）或硝酸纖維素膜） 封閉封閉 一抗一抗 洗滌洗滌 酶標二抗反應(yīng)酶標二抗反應(yīng) 洗洗滌滌 顯色或化學發(fā)光顯影。顯色或化學發(fā)光顯影。 SDSPAGE電泳示意圖電泳后轉(zhuǎn)膜，然后用特定的

13、抗體來檢測靶蛋白Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20 M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading controlHour

14、s 0 4 8 16Western Blot實驗注意的問題 （1） 蛋白質(zhì)電泳： 常用常用SDS-PAGESDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì) 非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) Tris-Tricine膠電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套！聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套！Western Blot實驗注意的問題 （2）轉(zhuǎn)膜： 戴手套戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致！濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致！ 以適量的、凝膠和膜1530 min，如果是PVD

15、F膜，必須先用甲醇激活后浸泡。 方向正確方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極。 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。排去濾紙、膠和膜間的氣泡。 電轉(zhuǎn)時間電轉(zhuǎn)時間：100V 1-2h100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇。 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置。Western Blot實驗注意的問題 （3）封閉： 用5脫脂奶粉或3BSA。 （含（含0.10.1Tween20 TBSTween20 TBS或或PBSPBS配制）配制） 時間：室溫2h或4C過夜Western Blot實驗注意的問題（

16、4）顯色或顯影： 顯色：辣根過氧化物酶：底物為DAB。堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT。 化學發(fā)光顯影：化學發(fā)光顯影：最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：注意：化學發(fā)光前將膜用不含化學發(fā)光前將膜用不含Tween20Tween20的的TBSTBS或或PBSPBS洗滌一次，洗滌一次， 曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定。曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定。Western Blot實驗注意的問題 （5）膜的再利用： 化學發(fā)光后的硝酸纖維素膜化學發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tr

17、is-HCI含2SDS和100mm的 2ME ），用不同的一抗進行雜交，檢測其它用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復(fù)使用蛋白的表達情況。一張膜可以重復(fù)使用3 34 4次次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交。Western blot操作視頻操作視頻ELISA 原理： ELISAELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。標記

18、的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好重復(fù)性好。 ELISA ELI

19、SA 常用的酶和底物常用的酶和底物辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測波長492 nm； 底物為TMB， 藍綠色， 檢測波長450 nm。 堿性磷酸酶堿性磷酸酶，底物為PNPP（對消基苯磷酸酯）,黃色， 檢測波長405 nm。 ELISA各步驟的反應(yīng)時間： 包被包被：242436h36h，蛋白濃度為15 ug/ml。 封閉：封閉：37C 2h2h 或4C過夜夜（3BSA）。 樣本反應(yīng)時間樣本反應(yīng)時間：37C 45 min-1 h45 min-1 h。 酶標抗體反應(yīng)時間酶標抗體反應(yīng)時間： 37C 45 min-1 h45 min-1 h。 顯色時間：15 min(15

20、min(避光）避光）。 實驗要設(shè)對照。實驗要設(shè)對照。 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?。可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?。ELISA的類型1. 間接法測抗體：間接法是檢測抗體常用的方法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗抗體抗體，檢測檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性雜交瘤上清特異性抗體的篩選抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。方法：方法： 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標二抗 洗滌 顯色反應(yīng) 終止反應(yīng) ELISA Reader檢測 OD值。ELISA的類型 2. 雙抗體夾心法測

21、抗原： 是檢測抗原最常用的方法是檢測抗原最常用的方法。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 常用的組合：常用的組合：單克隆抗體多克隆抗體單克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體 后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 用途：用途：測定二價或二價以上的大分子抗原測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用但不適用 于測定半抗原及小分子單價抗原于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形 成兩位點夾心。例如各種細胞因子的檢測各種細胞因子的檢測。ELISA的類型 3. 競爭法測抗原： (1

22、)(1)抗體固相測抗原：抗體固相測抗原：小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。愈淺。方法：方法：抗體包被 封閉 同時加入待測抗原和酶標抗原 洗滌 酶底物 顯色 ELISA reader檢 測。ELISA的類型 3. 競爭法測抗原： （2）抗原固相測抗原：其原理是標本中的抗原和固相抗原與一

23、定量的標記過的抗體競爭結(jié)合。其原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的標記過的抗體競爭結(jié)合。標本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。標本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法: a: 抗原包被96孔板； b:封閉; c: 待測抗原與抗體反應(yīng)一定時間； d: 加入96孔板； e: 洗滌； f：加入酶標二抗； g：洗滌； h：顯色和檢測。如臨床血清樣本的檢測以及細胞培養(yǎng)上清的檢測。如臨床血清樣本的檢測以及細胞培養(yǎng)上清的檢測。ELISA的類型 4. IgM4. IgM抗體的檢測抗體的檢測: :(1)(1)間接法間接法： 間接法間接法ELISAELISA一般僅適用于檢測總抗體或一般僅適用于檢測總抗體或IgGIgG抗體?？贵w。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗如果用抗IgMIgM作為二抗，間接測作為二抗，間接測定定IgMIgM抗體，必須先將標本用抗體，必須先將標本用A A蛋白或抗蛋白或抗IgGIgG抗體