生物大分子相互作用

1、生物大分子相互作用生物大分子相互作用EGFR-ERK/MAPK信號(hào)通路核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 生命系統(tǒng)復(fù)雜性最重要的特征不僅在于其組成成分的復(fù)雜性，更在于各組成成分之間的關(guān)系，而在所有的這些關(guān)系中，蛋白質(zhì)之間的相互作用在形成幾乎所有生命系統(tǒng)、調(diào)控各種生理/病理進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。BAKER M. (2012). Proteomics: The interaction map. Nature, 484, 271-5.互互 作作 組組蛋白與蛋白相互作用 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以被表示成為一個(gè)無(wú)向圖，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白質(zhì)，每條邊表示一對(duì)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是

2、大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子或是與其他蛋白質(zhì)一起發(fā)揮作用的。通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿調(diào)節(jié)心肌收縮 我們體內(nèi)有些肽是細(xì)胞間的化學(xué)信號(hào)，控制著情緒、行為、壓力應(yīng)答、血壓、消化和癌癥發(fā)展。它們一般與細(xì)胞膜上的受體蛋白相互作用，例如G蛋白偶聯(lián)受體GPCR。GPCR負(fù)責(zé)將信息傳達(dá)到細(xì)胞內(nèi)的G蛋白，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的細(xì)胞反應(yīng)。用藥物激活這類GPCR可以改善相關(guān)疾病的治療，不幸的是這類藥物的研發(fā)特別困難，其中有部分原因就是缺少結(jié)合狀態(tài)或激活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)信息。HAUSCH F, HOLSBOER F. (2012). Structural biology: Snapshot of an activated pept

3、ide receptor. Nature.DNA與蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)相互作用增強(qiáng)子 ( transcriptional enhancer)：是真核生物基因轉(zhuǎn)錄中另一種順式調(diào)控元件，常位于啟動(dòng)子上游7001000bp處，離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)，可提高轉(zhuǎn)錄效率。噬菌體展示酵母雙雜交技術(shù)免疫共沉淀染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)表面等離子共振熒光共振能量轉(zhuǎn)移串聯(lián)親和純化生物大分子相互作用研究方法動(dòng)畫將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基

4、因），若X和Y沒(méi)有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用 用途優(yōu)點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問(wèn)題提供了有利的手段和方法。缺點(diǎn)1、它并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。因?yàn)槿诤系鞍紫嗷プ饔眉せ顖?bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。2、假陽(yáng)性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽(yáng)性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽(yáng)性原因

5、不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。3、在酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長(zhǎng)和報(bào)告基因的表達(dá)。廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域噬菌體展示的基本原理 (1)在p 和p 衣殼蛋白的N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)保持的外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識(shí)別；(2)利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵?panning)方法，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體；(3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過(guò)分泌型噬菌體的單鏈DNA 測(cè)序推導(dǎo)

6、出來(lái). 應(yīng)用噬菌體展示，可合成、篩選到許多我們想要的蛋白（如融合肽、抗體、酶），這些蛋白具有預(yù)期的催化特性或結(jié)合親和力，或者具有用于胞內(nèi)、胞外診斷、人體疾病免疫治療和生物催化作用時(shí)所需的特異性。用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來(lái)的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白該技術(shù)主要應(yīng)用于：1.組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥物開(kāi)發(fā)研究將基因組DNA芯片（chi

7、p）技術(shù)與染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）相結(jié)合Chip Seq由于ChIP-Seq的數(shù)據(jù)是DNA測(cè)序的結(jié)果，為研究者提供了進(jìn)一步深度挖掘生物信息的資源，研究者可以在以下幾方面展開(kāi)研究： （1）判斷DNA鏈的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾； （2）檢測(cè)RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的精確定位； （3）研究組蛋白共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系； （4）CTCF轉(zhuǎn)錄因子研究。 實(shí)時(shí)分析，簡(jiǎn)便快捷地監(jiān)測(cè)DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間以及藥物蛋白質(zhì)、核酸核酸、抗原抗體、受體配體等等生物分子之間的相互作用，在生命科學(xué)、醫(yī)療檢測(cè)、藥物篩選、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢測(cè)、法

8、醫(yī)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用需求。表面等離子共振原理表面等離子共振原理l1. 消逝波l2. 等離子波l3. SPR的光學(xué)原理1.消逝波l當(dāng)光從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì)時(shí)（n1n2）就會(huì)有全反射現(xiàn)象的產(chǎn)生。n1 sin1 = n2 sin2菲涅爾定理：菲涅爾定理：密疏密疏1.消逝波這表示沿X軸方向傳播而振幅衰減的一個(gè)波，這就是消逝波。全反射的光波會(huì)透過(guò)光疏介質(zhì)約為光波波長(zhǎng)的一個(gè)深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)。光的總能量沒(méi)有發(fā)生改變。透入光疏介質(zhì)的光波成為消逝波。 界面疏密2.等離子波 等離子體 等離子體通常是指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。 金屬

9、表面等離子波 把金屬的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，這實(shí)際上也是一種等離子體。由于電磁振蕩形成了等離子波。-熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。GFP近年來(lái)發(fā)展出了多種突變體，通過(guò)引入各種點(diǎn)突變使發(fā)光基團(tuán)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均發(fā)生變化而發(fā)出不同顏色的熒光，有BFP，YFP，CF

10、P等。這些突變體使GFP應(yīng)用于FRET成為可能,為FRET技術(shù)用于活體檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用提供了良好的支持。標(biāo)簽共分3部分：蛋白A鈣調(diào)素結(jié)合多肽(calmodulin binding peptide。CBP)中間連接的煙草病毒(TEV)蛋白酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)。帶有TAP標(biāo)簽的融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)，且與內(nèi)源相互作用蛋白形成復(fù)合物，細(xì)胞裂解后經(jīng)IsG偶聯(lián)的層析柱純化，蛋白A與IgG特異結(jié)合，從而使含有標(biāo)簽的復(fù)合物得到第一次純化。為除去與柱填料非特異結(jié)合的蛋白，用TEv酶切割分離蛋白A標(biāo)簽，使含有靶蛋白的復(fù)合物與層析柱分離，并經(jīng)過(guò)鈣調(diào)素偶聯(lián)的親和層析柱進(jìn)行第二次純化，靶蛋白上的CBP標(biāo)簽可與鈣調(diào)素結(jié)合；在加