講義動(dòng)物微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、 動(dòng)物微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)指導(dǎo)教師：郭春秋 李娜目 錄實(shí)驗(yàn)1細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)2細(xì)菌的芽胞、莢膜、鞭毛染色及運(yùn)動(dòng)性觀察實(shí)驗(yàn)3 微生物細(xì)胞形態(tài)及菌落特征觀察實(shí)驗(yàn)4培養(yǎng)基制作、滅菌消毒及無(wú)菌操作接種技術(shù)實(shí)驗(yàn)5微生物的分離純化與稀釋平板菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)6微生物細(xì)胞大小測(cè)定及顯微鏡直接計(jì)數(shù)附錄1 常用培養(yǎng)基配方附錄2 常用染色液的配制附錄3 常用試劑和指示劑的配制參考書(shū)目實(shí)驗(yàn)1細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法；2、 學(xué)習(xí)顯微鏡油鏡觀察的方法；二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色；2、 細(xì)菌的革蘭氏染色；三、實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單染色法是一種最基本的染色方法，是只用一

2、種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)的方法。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，而堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。所以通常采用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、孔雀綠或蕃紅）等進(jìn)行染色，當(dāng)這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使菌體著色。簡(jiǎn)單染色一般難于辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的重要鑒別染色反應(yīng)。通過(guò)革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類。這是因?yàn)閮深惥募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同，G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增

3、加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)過(guò)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，即紫色。四、實(shí)驗(yàn)材料1、活材料：培養(yǎng)1216h的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培養(yǎng)24h 的大腸桿菌（Escherichia coli）。2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復(fù)紅、二甲苯、香柏油。五、實(shí)驗(yàn)用品

4、廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、吸水紙、滴管、玻片擱架、鑷子、無(wú)菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有75%乙醇的玻片回收缸、生物顯微鏡等。六、實(shí)驗(yàn)方法（一）簡(jiǎn)單染色1、涂片：用消毒棉球擦拭雙手，用鑷子取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右兩端各加一滴蒸餾水，按無(wú)菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金芽胞桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌懸液。再取干凈載玻片一塊，挑剛制成的蘇云金芽胞桿菌濃菌懸液23環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取23環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方用文火烘干。是否還有其它方法？3、固定：

5、手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰23次固定，以不燙手為宜。為什么要進(jìn)行該步驟？4、染色：用將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色12min。5、水洗：水洗去涂片上的染色液。6、干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，勿將菌體擦掉。7、鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。怎樣操作才能做到既快而又不易損壞玻片地調(diào)準(zhǔn)焦距？（二）革蘭氏染色1、涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片法相同。涂片厚薄對(duì)結(jié)果有影響嗎？2、晾干：與簡(jiǎn)單染色法相同。3、固定：與簡(jiǎn)單染色法相同。4、結(jié)晶紫初染色：將玻片置于廢液缸玻

6、片擱架上，加適量的結(jié)晶紫染色液染色1min，以蓋滿細(xì)菌涂面為宜。之后傾去染色液，用水小心地沖洗。 5、碘液媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min后用水洗去碘液。此步可否省去？ 6、脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇，脫色2025s至流出液無(wú)色，立即水洗。為什么要立即水洗？7、復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染25min，然后用水洗去涂片上的番紅染色液。 8、晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。9、鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。10、實(shí)驗(yàn)完畢后的處理 將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦試干凈:先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去；用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次；再用

7、干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次，注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦試。 觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中。 顯微鏡復(fù)原并做好使用情況登記。七、作業(yè)與思考（一）、繪圖1、 簡(jiǎn)單染色后繪出蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的形態(tài)圖。2、 革蘭氏染色后繪圖并注明金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。（

8、二）思考題1、 在取菌涂片的過(guò)程中怎樣操作才能保證斜面菌種不受到污染？2、 革蘭氏染色反應(yīng)成敗的關(guān)鍵操作是哪一步？為什么？3、 為什么革蘭氏染色法要選用幼齡菌種？實(shí)驗(yàn)2細(xì)菌的芽胞、莢膜、鞭毛染色及運(yùn)動(dòng)性觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌芽胞染色法，初步了解芽胞桿菌的形態(tài)特征；2、 學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌莢膜染色法；3、 學(xué)習(xí)并初步掌握細(xì)菌鞭毛染色法，觀察細(xì)菌鞭毛的形態(tài)特征；4、 學(xué)習(xí)用壓滴法和懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 細(xì)菌芽胞染色；2、 細(xì)菌莢膜染色；3、 細(xì)菌鞭毛染色；4、 細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性觀察。三、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的芽胞壁較細(xì)胞壁厚而致密，透性低，不易著色，也不易脫色，若用一般染色法只能

9、使菌體著色而芽胞不著色，芽胞呈無(wú)色透明狀。芽胞染色法就是基于細(xì)菌的芽胞和菌體對(duì)染料的親和力不同，用不同的染料進(jìn)行著色，使芽胞和菌體呈現(xiàn)不同的顏色而加以區(qū)別。所有的芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)芽胞著色時(shí)，菌體也會(huì)著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會(huì)脫色。再用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，形成鮮明的對(duì)照，便于觀察。莢膜是包在細(xì)菌細(xì)胞壁外面的一層黏膠狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，成分為多糖、糖蛋白或多肽，與染料間的親和力弱，不易著色，故通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一淺色

10、或無(wú)色的透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形，影響觀察結(jié)果。細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為1020nm ,超過(guò)了普通光學(xué)顯微鏡的分辨力，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，將鞭毛直徑加粗，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。細(xì)菌是否具有鞭毛是細(xì)菌分類鑒定重要特征之一。采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態(tài)、著生位置和數(shù)目，但此法既費(fèi)時(shí)又麻煩。如果只需查清供試菌是否有鞭毛，可采用懸滴法或

11、水封片法即壓滴法，直接在光學(xué)顯微鏡下檢查活細(xì)菌是否具有運(yùn)動(dòng)能力，以此來(lái)判斷細(xì)菌是否有鞭毛。此法較快速、簡(jiǎn)便。懸滴法就是將菌液滴加在潔凈的蓋玻片中央，在其周邊涂上凡士林，然后將它倒蓋在有凹槽的載玻片中央，即可放置在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。水封片法是將菌液滴在普通的載玻片上，然后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。細(xì)菌依賴鞭毛的運(yùn)動(dòng)方式，與鞭毛的排列形式和數(shù)目有關(guān)，但根據(jù)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方式，對(duì)鞭毛的數(shù)目和排列方式只能作大致判斷。單毛菌和叢毛菌多做直線運(yùn)動(dòng)，周毛菌多做翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。依賴鞭毛的運(yùn)動(dòng)稱為真性運(yùn)動(dòng)。無(wú)鞭毛細(xì)菌做左右顫動(dòng)而不改變其位置，這種運(yùn)動(dòng)稱為非真性運(yùn)動(dòng)，亦稱布朗運(yùn)動(dòng)。四、實(shí)驗(yàn)材料1、活材料：培養(yǎng)36h的

12、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）；培養(yǎng)35d的膠質(zhì)芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細(xì)菌”），該菌在甘露醇作碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，莢膜豐厚；培養(yǎng)1216h 的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏質(zhì)賽氏桿菌（Serratia marcescens ）或熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面菌種；培養(yǎng)1216h的枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及熒光假單胞菌（P

13、seudomonas Fluorescens）。2、染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液；Tyler法染色液、用濾紙過(guò)濾后的繪圖墨水、復(fù)紅染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CUSO4水溶液；硝酸銀染色液（包括A液和B液，）、Leifson 染色液；香柏油、二甲苯。五、實(shí)驗(yàn)用品小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、滴管、廢液缸、玻片擱架、接種環(huán)、擦鏡紙、吸水紙、鑷子、記號(hào)筆、洗瓶、凡士林、無(wú)菌水、水浴鍋、生物顯微鏡等。 六、實(shí)驗(yàn)方法（一）細(xì)菌芽胞染色1、改良的Schaeffer和Fulton氏染色法制備菌液

14、：加12滴無(wú)菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。為什么要制成濃稠的菌液？加染色液：加5%孔雀綠水溶液23滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。加熱：將此試管浸于沸水浴，加熱1520min。涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。固定：將涂片通過(guò)酒精燈火焰3次。脫色：用水洗直至流出的水中無(wú)孔雀綠顏色為止。復(fù)染：加番紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。2、Schaeffer與Fulton氏染色法涂片：按常規(guī)方法將

15、待檢細(xì)菌制成一薄的涂片。晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過(guò)23次。染色：加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后，將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，約維持1520min。加熱過(guò)程中要隨時(shí)添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。加熱時(shí)溫度可否太高？水洗：待玻片冷卻后，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無(wú)染色液為止。復(fù)染：用番紅液染色5min。水洗、晾干或吸干。鏡檢：先低倍、再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。（二）細(xì)菌莢膜染色細(xì)菌莢膜染色方法很多，其中以濕墨水方法較簡(jiǎn)便，并且適用于各種有莢膜的細(xì)菌。如用相差顯微鏡檢查則

16、效果更佳。1、負(fù)染色法制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取23環(huán)菌體放入水滴中混勻并涂布。干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。為什么不能在火焰上方烘干？染色：在涂面上加復(fù)紅染色液染色23min。水洗：用水洗去復(fù)紅染液。干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開(kāi)，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風(fēng)干。鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體紅色，莢膜無(wú)色透明。2、濕墨水法制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑23環(huán)菌體與其充分混合均勻。加蓋玻片：放一清潔蓋玻片

17、于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。加蓋玻片時(shí)勿留氣泡，以免影響觀察。鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。結(jié)果，背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。3、干墨水法制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑23環(huán)膠質(zhì)芽胞桿菌，與葡萄糖液充分混合，再加1環(huán)墨水，充分混勻。為什么加6%葡萄糖液？制片：左手執(zhí)玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開(kāi)，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。干燥：空氣中自然干燥。固定：用甲醇浸沒(méi)涂片，固定1min，立即傾去甲醇。干燥：在酒精燈上方，用文火

18、干燥。染色：用甲基紫染12min。水洗：用自來(lái)水輕洗，自然干燥。鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。4、Tyler法涂片：按常規(guī)法涂片，可挑23環(huán)菌體與水充分混合，并將黏稠的菌液盡量涂開(kāi)，但涂布的面積不宜過(guò)大。干燥：在空氣中自然干燥。染色：用Tyler染色液染57min。脫色：用20%CUCO4水溶液洗去結(jié)晶紫，脫色要適度，沖洗2遍即可。用吸水紙吸干，并立即加12滴香柏油于涂片處，以防止CUCO4結(jié)晶的形成。為什么是用20%CUCO4脫色，而不是用水洗脫色？鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。結(jié)果：背景

19、藍(lán)紫色，菌體紫色，莢膜無(wú)色或淺紫色。（三）細(xì)菌鞭毛染色1、鍍銀法染色清洗玻片選擇光滑無(wú)裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重迭，應(yīng)將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過(guò)濾液中，洗衣粉煮沸后用濾紙過(guò)濾，以除去粗顆粒，煮沸20min。取出稍冷后用自來(lái)水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡56天。濃洗液的成分是：重鉻酸鉀60g ,濃硫酸460mL ,水300mL；配制方法是：重鉻酸鉀溶解在溫水中，冷卻后再徐徐加入濃硫酸。使用前取出玻片，用自來(lái)水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。菌液的制備及制片菌齡較老的細(xì)菌容易脫落鞭毛，所以在染色前應(yīng)將待染細(xì)菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)

20、基斜面上連續(xù)移接35代，要求培養(yǎng)基表面濕潤(rùn)，斜面基部含有冷凝水，以增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力。最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)1216h。然后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液35環(huán)，移至盛有12mL無(wú)菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37恒溫箱中靜置10min。放置時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則鞭毛會(huì)脫落，讓幼齡菌的鞭毛松展開(kāi)。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。讓涂片自然干燥。用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。方法是將0.30.4%的瓊脂牛肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無(wú)菌平皿中，待凝固后，在平板中央點(diǎn)接活化了34代的細(xì)菌，恒溫培養(yǎng)1216

21、h后，取擴(kuò)散菌落邊緣的菌體制作涂片。染色滴加A液，染46min。用蒸餾水充分洗凈A液。用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持0.51min，加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū)。用蒸餾水洗，自然干燥。鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。2、改良Leifson染色法清洗玻片法同前。配制染料：見(jiàn)附錄2-9。染料配好后要過(guò)濾1520次后染色效果才好。菌液的制備及涂片。菌液的制備同前。用記號(hào)筆在潔凈的玻片上劃分34個(gè)相等的區(qū)域。放1滴菌液于第一個(gè)小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。干燥在空氣中自

22、然干燥。染色加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū)，依此類推，相隔時(shí)間可自行決定，其目的是確定最合適的染色時(shí)間，而且節(jié)約材料。水洗：在沒(méi)有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會(huì)增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時(shí)要多找一些視野，不要指望在12個(gè)視野中就能看到細(xì)菌的鞭毛。結(jié)果：菌體和鞭毛均染成紅色。（四）細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性觀察1、制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加34mL無(wú)菌水，制成輕度混濁的菌懸液。2、涂凡士林：取潔凈無(wú)油的蓋玻片1塊，在其四周涂少量的凡士林。3、滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，并用記號(hào)筆在菌液的邊

23、緣做一記號(hào)，以便在顯微鏡觀察時(shí)，易于尋找菌液的位置。4、蓋凹玻片：將凹玻片的凹槽對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，使菌液正好懸在凹槽的中央，再用鉛筆或火柴棒輕輕壓蓋玻片，使玻片四周邊緣閉合，以防菌液干燥（圖2-1）。若制水浸片，在載玻片上滴加一滴菌液，蓋上蓋玻片后即可置顯微鏡下觀察。圖2-1 懸滴標(biāo)本的制備（自黃秀梨）5、鏡檢：先用低倍鏡找到標(biāo)記，再稍微移動(dòng)凹玻片即可找到菌滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央高倍鏡觀察。由于菌體是透明的，鏡檢時(shí) 可適當(dāng)縮小光圈或降低聚光器以增大反差，便于觀察。鏡檢時(shí)要仔細(xì)辨別是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，還是分子作布朗運(yùn)動(dòng)，前者在視野下可

24、見(jiàn)細(xì)菌自一處游動(dòng)至它處，而后者僅在原處左右擺動(dòng)。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)速度依菌種不同而異，應(yīng)仔細(xì)觀察。結(jié)果：有鞭毛的枯草桿菌和假單胞菌可看到活躍的活動(dòng)，而無(wú)鞭毛的金黃色葡萄球菌不運(yùn)動(dòng)。七、作業(yè)與思考（一）繪圖：繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖；繪出Bacillus mucilaginosus的莢膜和菌體形態(tài)圖，并注明各部位的名稱；繪出鞭毛菌的形態(tài)圖；繪出所看到的細(xì)菌的形態(tài)圖，并用箭頭表示其運(yùn)動(dòng)方向。（二）思考題1、用簡(jiǎn)單染色法能否觀察到細(xì)菌的芽胞？2、若涂片中觀察到的只是大量游離芽胞，很少看到芽胞囊及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因？3、通過(guò)莢膜染色法染色后，為什么被包在莢膜里的菌體著色而莢膜不著色？4、用鞭

25、毛染色法準(zhǔn)確鑒定一株細(xì)菌是否具有鞭毛，要注意哪些環(huán)節(jié)？5、懸滴法中，為什么要涂凡士林？為什么加的菌液不能太多？如果發(fā)現(xiàn)顯微鏡視野內(nèi)大量細(xì)菌向一個(gè)方向流動(dòng)，你認(rèn)為是什么原因造成的？實(shí)驗(yàn)3 微生物細(xì)胞形態(tài)及菌落特征觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)用放線菌的玻璃紙培養(yǎng)物觀察放線菌的個(gè)體形態(tài)；2、學(xué)習(xí)插片培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；3、學(xué)習(xí)放線菌的印片染色法；4、學(xué)習(xí)自制水浸片觀察霉菌的形態(tài)；5、學(xué)習(xí)酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)及觀察方法；6、初步掌握四大類微生物的菌落特征，學(xué)會(huì)從菌落特征識(shí)別四大類微生物的方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；2、 用插片培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；3、 放線菌的印片

26、染色法；4、 霉菌水浸標(biāo)本片的制備與觀察；5、 酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)與觀察；6、微生物菌落特征觀察微生物菌落特征觀察。三、實(shí)驗(yàn)原理放線菌自然生長(zhǎng)的個(gè)體形態(tài)觀察，目前多采用玻璃紙瓊脂透析培養(yǎng)法。玻璃紙具有半透膜特性，其透光性與載玻片基本相同，采用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)，能使放線菌生長(zhǎng)在玻璃紙上，然后將長(zhǎng)菌的玻璃紙剪取小片，貼放在載玻片上，用顯微鏡鏡檢可觀察到自然生長(zhǎng)的放線菌個(gè)體形態(tài)。另外，采用插片培養(yǎng)法也能觀察放線菌的個(gè)體形態(tài)。放線菌的孢子絲形狀和孢子排列情況是放線菌分類的重要依據(jù)，為了不打亂孢子的排列情況，常用印片法進(jìn)行制片觀察?，F(xiàn)在，放線菌孢子的排列和孢子的表面形狀是用電子顯微鏡來(lái)進(jìn)行觀察的

27、。霉菌的營(yíng)養(yǎng)體是分枝的絲狀體。其個(gè)體比細(xì)菌和放細(xì)菌大得多，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲中又可分化出繁殖菌絲，不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。酵母菌的有性繁殖一般產(chǎn)生子囊孢子。其形成過(guò)程為：兩營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞各伸出一個(gè)小突起而相接觸，使兩個(gè)細(xì)胞結(jié)合起來(lái)，而后接觸處的細(xì)胞溶解，經(jīng)質(zhì)配和核配后，形成雙倍體核，原來(lái)的細(xì)胞形成合子。此雙倍體細(xì)胞可以進(jìn)行芽殖。在適宜條件下，合子減數(shù)分裂，雙倍體核分裂成48個(gè)單倍體核，核外再圍以原生質(zhì)逐漸形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母細(xì)胞壁演變而來(lái)的子囊即原來(lái)的二倍體細(xì)胞中。子囊孢子的形成與否及其數(shù)量和形狀，是鑒定酵母菌的依據(jù)之一。將釀酒酵母（Saccharomyces

28、 cerevisiae）從營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上移植到含有醋酸鈉和葡萄糖或棉籽糖的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，于適溫下培養(yǎng)，即可誘導(dǎo)其子囊孢子的形成。本實(shí)驗(yàn)即以釀酒酵母為材料觀察酵母菌的子囊孢子。區(qū)分和識(shí)別各大類微生物通常包括菌落特征和個(gè)體形態(tài)的觀察。由于微生物個(gè)體形態(tài)結(jié)構(gòu)、分裂方式、運(yùn)動(dòng)能力、生理特征以及產(chǎn)生色素等能力的不同，因而在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落各有特點(diǎn)。微生物的個(gè)體形態(tài)是菌落特征的基礎(chǔ)，而菌落特征又是個(gè)體形態(tài)的集中反應(yīng)。每一大類微生物都有其獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)，故它們?cè)谝欢ǖ呐囵B(yǎng)條件下都有各自的菌落特征，即它們的菌落在形態(tài)、大小、色澤、透明度、粘稠度、邊緣情況等都有明顯的差異。一般根據(jù)這些差異就能識(shí)別四大

29、類微生物。此法簡(jiǎn)便快速，在科研和生產(chǎn)中?？刹捎?。四、實(shí)驗(yàn)材料1、活材料：細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；放線菌：灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus ），培養(yǎng)57d 的紫色直絲鏈霉菌（Streptomyces uiolaceorectus），吸水鏈霉菌“5102”（Streptomyces hygroscopicus var. Yingchengensis（5102）；酵母菌：釀酒酵母（Saccharomyces cereuisiae），產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)；霉菌：桔青霉（

30、Penicillum citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）等；2、培養(yǎng)基：高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、克氏培養(yǎng)基或麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的試管斜面、3、試劑：石炭酸復(fù)紅染色液、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液、50%酒精（V/V）、3%的酸性酒精、美藍(lán)染色液、50g/L的KOH溶液、碘液、1%碳酸氫鈉溶液、甲基綠。五、實(shí)驗(yàn)用品無(wú)菌平皿、玻璃紙、9mL無(wú)菌水若干支、酒精燈、火柴、接種環(huán)、玻璃刮鏟、1mL無(wú)菌吸管、剪刀、小刀、有凹窩的載玻片、載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、滴管、玻璃瓶、天平、pH試紙、試管、玻璃缸、培養(yǎng)皿、藥棉、放大鏡、生物顯微鏡等。六、實(shí)驗(yàn)方法（一）用玻璃紙瓊脂平板

31、透析培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)1、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報(bào)紙隔層迭好后滅菌。2、將放線菌斜面菌種制成103的孢子懸液。3、將高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15mL左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無(wú)菌操作下用鑷子將無(wú)菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。4、分別用1mL無(wú)菌吸管取0.2mL吸水鏈霉菌“5102”孢子懸液、紫色直絲鏈霉菌孢子懸液分別滴加在兩個(gè)玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基上，并用無(wú)菌玻璃刮鏟涂抹均勻。5、將接種的玻璃紙瓊脂平板置2830下培養(yǎng)。6、在培養(yǎng)至3d ，5d ，7d 時(shí)，從溫室中取出平皿。在無(wú)菌環(huán)境下。打開(kāi)培養(yǎng)皿，用無(wú)菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無(wú)

32、菌剪刀取小片置于載玻片上用顯微鏡觀察?？梢?jiàn)到放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。（二）放線菌的插片培養(yǎng)法放線菌的插片培養(yǎng)是將放線菌菌種制成孢子懸液，濃度以102103為好，取0.2mL放在適合放線菌生長(zhǎng)的平板培養(yǎng)基上，用玻璃刮鏟涂布均勻，然后將滅過(guò)菌的蓋玻片斜插入固體培養(yǎng)基中，置2832下培養(yǎng)，35d 后取出蓋玻片放在載玻片上鏡檢，可見(jiàn)自然生長(zhǎng)的放線菌個(gè)體形態(tài)?？梢?jiàn)到放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。（三）放線菌的印片染色法1、制片：取干凈載玻片一塊，用小刀切取放細(xì)菌培養(yǎng)體一塊，應(yīng)帶培養(yǎng)基切下，放在載玻片上，用另一載玻片對(duì)準(zhǔn)菌塊的氣生菌絲輕輕按壓，然后將載玻片垂直拿起。注意不要使培養(yǎng)體在玻片

33、上滑動(dòng)，否則會(huì)打亂孢子絲的自然形態(tài)。2、固定：將印有放線菌的涂面朝上，通過(guò)酒精燈火焰23次加熱固定。3、染色：用石炭酸復(fù)紅染色液染色1min。然后水洗，晾干?？煞裼梦埼?4、鏡檢：先用低倍鏡，后用高倍鏡，最后用油鏡觀察，可見(jiàn)孢子絲、孢子的形態(tài)及孢子排列情況。（四）霉菌水浸標(biāo)本片的制備與觀察在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液或蒸餾水，用解剖針或鑷子從生長(zhǎng)有霉菌的平板中挑取少量帶有孢子的霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤(rùn)，再用蒸餾水將浸過(guò)的菌絲洗一下，然后放入載玻片上的液滴中，仔細(xì)地用解剖針將菌絲分散開(kāi)來(lái)。蓋上蓋玻片，勿使產(chǎn)生氣泡，且不要再移動(dòng)蓋玻片，先用低倍鏡觀察，必要時(shí)轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢，并記

34、錄觀察結(jié)果。（五）酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)與觀察1、子囊孢子的培養(yǎng)：將釀酒酵母用馬鈴薯培養(yǎng)基活化23代后，轉(zhuǎn)接于克氏或麥?zhǔn)闲泵媾囵B(yǎng)基上，于25培養(yǎng)35d ，即可形成子囊孢子。2、制片與觀察：于載玻片上加蒸餾水一滴，取子囊孢子培養(yǎng)體少許放入水滴中制成涂片，干燥固定后用石炭酸復(fù)紅染色液加熱染色510min,不能沸騰，傾去染液，用酸性酒精沖洗3060s脫色，再用水洗去酒精，最后加美藍(lán)染色液染色，510s 后用水洗去染液，用吸水紙吸干后置顯微鏡下鏡檢。子囊孢子為紅色，菌體為青色。亦可不經(jīng)染色直接制水浸片觀察。水浸片中的酵母菌的子囊為圓形大細(xì)胞，內(nèi)有24個(gè)圓形的小細(xì)胞即為子囊孢子。（六）微生物菌落特征觀察1

35、、已知菌落的觀察與識(shí)別 細(xì)菌和酵母菌菌落的觀察和識(shí)別 細(xì)菌和酵母菌都是單細(xì)胞微生物，菌落由菌體堆積而成，有共同的特征，較濕潤(rùn)、光滑、透明、易挑起，菌落的正反面、邊緣和中央顏色一致，質(zhì)地較均勻。但兩者也有區(qū)別，細(xì)菌的菌落較小、較薄、較透明、較濕潤(rùn)、顏色多樣，較有“細(xì)膩”感。有鞭毛的細(xì)菌其菌落較扁平、邊緣不規(guī)則。有芽孢的細(xì)菌菌落粗糙、多皺、不透明。酵母的菌落比細(xì)菌的大、厚，外觀較稠、較不透明。 放線菌和霉菌菌落的觀察和識(shí)別 放線菌和霉菌的細(xì)胞都呈絲狀，在固體培養(yǎng)基上都有基內(nèi)菌絲即營(yíng)養(yǎng)菌絲和氣生菌絲的分化，因此菌落由菌絲相互纏結(jié)而成，外觀干燥、不透明，呈蛛絲狀或絨毛狀，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密不易挑起。

36、菌絲、孢子常分泌不同色素，故使菌落的正反面、中央和邊緣表現(xiàn)不同的顏色。兩者也有區(qū)別：放線菌比霉菌菌絲細(xì)，生長(zhǎng)后期分化的孢子絲有大量的孢子，因而它的菌落比霉菌小而緊密，表面呈干粉狀。霉菌的菌絲比放線菌粗長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)快而松散，所以菌落大而疏松。按照“菌落形態(tài)觀察記錄表”的項(xiàng)目，認(rèn)真觀察并比較四大類微生物的異同。1、認(rèn)識(shí)未知菌落 認(rèn)真觀察各編號(hào)的未知菌落的各項(xiàng)特征，運(yùn)用區(qū)別各大類微生物的原則，分別歸入相應(yīng)的大類中，并將鑒別的結(jié)果填入“微生物菌落形態(tài)觀察記錄表”中。微生物菌落形圖3-1 微生物菌落的形態(tài)（自趙斌）態(tài)參見(jiàn)圖3-1。 七、作業(yè)與思考（一）繪圖1、繪出吸水鏈霉菌“5102”和紫色直絲鏈霉菌自

37、然生長(zhǎng)的個(gè)體形態(tài)圖；2、繪出吸水鏈霉菌“5102”和紫色直絲鏈霉菌的孢子絲和孢子的形態(tài)圖；3、 繪出根霉、青霉、曲霉的個(gè)體形態(tài)圖，并注明各部位名稱；4、繪出酵母菌的子囊、子囊孢子形態(tài)圖并注明各部位的名稱；4、 將各菌落的觀察結(jié)果記入下表3-1中，并報(bào)告各編號(hào)菌落的觀察、識(shí)別結(jié)果。（二）思考題1、為什么在培養(yǎng)基上放了玻璃紙后，放線菌仍能生長(zhǎng)？2、印片法成敗關(guān)鍵在哪里？3、四大類微生物的菌落形態(tài)有何異同？為什么？4、從微生物菌落形態(tài)區(qū)分四大類微生物有何意義？表3-1 微生物菌落形態(tài)觀察記錄表大類菌名或編號(hào)大小（mm）形成方式表面形態(tài)邊緣干濕顏色光澤厚度透明度細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌未知菌12345實(shí)驗(yàn)

38、4培養(yǎng)基制作、滅菌消毒及無(wú)菌操作接種技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌及真菌常規(guī)培養(yǎng)基的制備方法；2、學(xué)習(xí)微生物操作中常用的滅菌與消毒方法；3、掌握高壓蒸汽滅菌鍋的滅菌原理及使用方法；4、學(xué)習(xí)并掌握棉塞制作及常用器皿包扎的方法；5、學(xué)習(xí)并掌握無(wú)菌操作技術(shù)要點(diǎn)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備；2、 高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備；3、 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的制備；4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎；5、 常用滅菌和消毒方法簡(jiǎn)介；6、 用高壓蒸汽滅菌鍋對(duì)培養(yǎng)基和器皿進(jìn)行滅菌；7、 微生物接種技術(shù)介紹。三、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基（culture medium）是指利用人工方法將適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累

39、代謝產(chǎn)物的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，主要用于微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定、菌種保藏或積累代謝產(chǎn)物等方面。其種類很多，依微生物的種類、營(yíng)養(yǎng)類型以及研究目的的不同而異，實(shí)驗(yàn)教學(xué)常用的有以下三種。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是細(xì)菌學(xué)研究最常用的天然培養(yǎng)基。在配方中不加瓊脂時(shí)稱之為肉湯培養(yǎng)基。加入瓊脂配制的固體培養(yǎng)基一般用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和測(cè)數(shù)等。高氏一號(hào)培養(yǎng)基是一種合成培養(yǎng)基，常用于分離和培養(yǎng)放線菌。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是一種半合成培養(yǎng)基，常用于分離和培養(yǎng)多種真菌。四、實(shí)驗(yàn)材料1、藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaC1、10%NaOH溶液、10%鹽酸溶液；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H

40、2O、KNO3、NaCI、FeSO4·7H2O、瓊脂。2、材料：新鮮馬鈴薯、蔗糖或葡萄糖。五、實(shí)驗(yàn)用品小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH試紙、分裝漏斗、衣棉、橡皮圈、100 mL燒杯、標(biāo)簽紙、電爐、菜板、小刀、紗布、18mm×180mm試管。六、實(shí)驗(yàn)方法（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備1、培養(yǎng)基配方牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaC1 5.0g、瓊脂20.0g、自來(lái)水1000 mL、pH7.0。2、操作步驟 在100 mL小燒杯中稱取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，加50 mL自來(lái)水，置電爐攪拌加熱至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。 向小鋁鍋中加入500

41、 mL自來(lái)水，將溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入鋁鍋中并用自來(lái)水洗23次。加入5.0gNaC1，在電爐上邊加熱邊攪拌。 加入洗凈的瓊脂條，繼續(xù)攪拌，加熱至瓊脂完全熔化，補(bǔ)足水量至1000 mL。 用玻棒沾少許液體，用pH試紙測(cè)定pH值。用NaOH或HC1調(diào)至pH7.0。 分裝漏斗分裝于18mm×180mm試管中，塞好棉塞，裝入小鐵絲筐，然后用舊報(bào)紙將棉塞部分包好。是否可以擱置幾天后進(jìn)行滅菌？ 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。 分裝到試管中的培養(yǎng)基滅菌后趁熱擺放斜面。（二）高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備1、 培養(yǎng)基配方可溶性淀粉20.0g、硝酸鉀1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4

42、3;7H2O 0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL、pH7.27.4。2、操作步驟 用搪瓷杯量取自來(lái)水500 mL置小鋁鍋中，在電爐上加熱。 根據(jù)培養(yǎng)基配方，依次稱取各種藥品加入搪瓷杯中，攪拌均勻。其中可溶性淀粉稱入100 mL燒杯中，加入50 mL自來(lái)水調(diào)成糊狀，待培養(yǎng)液沸騰時(shí)及如鋁鍋中，邊加邊攪拌，以防糊底。 加入20g浸洗過(guò)的瓊脂煮沸至熔化，補(bǔ)足1000 mL水量，調(diào)pH7.27.4。 趁熱分裝于18mm×180mm試管，斜面試管每管8 mL，若倒平板則每管裝15 mL，裝量根據(jù)需要而定。 塞好棉塞，裝入小鐵絲筐，并用舊報(bào)紙將棉塞部分包

43、好，貼好標(biāo)簽。 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。 若有斜面試管，在滅菌后及時(shí)擺放斜面。（三）馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的制備1、培養(yǎng)基成分去皮的馬鈴薯200g 、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂20g、自來(lái)水1000 mL、pH 自然2、操作步驟 稱取去皮新鮮馬鈴薯200g 切成1cm 見(jiàn)方小塊放于小鋁鍋中，加1000m L 自來(lái)水，置電爐上煮沸20min 后，用雙層紗布過(guò)濾。濾液計(jì)量體積后倒入小鋁鍋中煮沸。 加入稱好的蔗糖、瓊脂，加熱攪拌至瓊脂完全熔化，并補(bǔ)足水量至1000m L。 趁熱用分裝漏斗分裝于18mm×180mm試管，斜面以8 m L為宜，柱狀15m L為宜。分裝完畢后做好棉塞，裝

44、入小試管筐并捆好，寫(xiě)好標(biāo)簽。 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。若需擺斜面，滅菌后趁熱擺成斜面。（四）棉塞的制作及玻璃器皿的包扎圖4-1 棉塞的做法（自趙斌）(a)棉塞的制作過(guò)程；(b)正誤棉塞棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染，二是保證通氣良好。因此棉塞質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有很大的影響。正確的棉塞要求形狀，大小，松緊與試管口或三角瓶口完全適合，過(guò)緊則防礙空氣流通，操作不便；過(guò)松則達(dá)不到濾菌的目的。加塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長(zhǎng)度的1/3在試管口外，2/3在試管口內(nèi)。如圖4-1(b)所示。做棉塞的棉花要選纖維較長(zhǎng)的，一般不用脫脂棉做棉塞。因?yàn)樗菀孜儩?，造成污染，而且價(jià)格也貴。做棉塞過(guò)程如圖4-1（

45、a）所示。此外,現(xiàn)配現(xiàn)用的培養(yǎng)基和無(wú)菌水，還可使用硅膠橡膠塞或聚丙烯塑料試管帽。在微生物實(shí)驗(yàn)和科研中，往往要用到通氣塞。所謂通氣塞就是幾層紗布，一般8層，相互重迭而成，或是在兩層紗布間均勻鋪一層棉花而成。這種通氣塞通常加在裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶口上。經(jīng)接種后，放在搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，以獲得良好的通氣促使菌體的生長(zhǎng)或發(fā)酵。（五）常用滅菌和消毒方法采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外所有的微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施稱之為滅菌（sterilization）。消毒（disinfection）則是用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體上絕大多數(shù)微生物主要是病原微生物和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)際上是部分滅

46、菌。滅菌與消毒方法有很多種，可分為物理法和化學(xué)法兩大類。實(shí)驗(yàn)室最常用的滅菌方法是物理法，即利用高溫處理達(dá)到殺菌效果。高溫的致死作用，主要是是使微生物的蛋白蛋和核酸等重要生物大分子發(fā)生變性。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。這是因?yàn)闈駸嵯聼崃恳子趥鬟f，更容易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性；過(guò)濾除菌、射線滅菌也是常見(jiàn)的物理法。此外，化學(xué)藥物滅菌和消毒等也是微生物學(xué)操作中不可缺少的常用方法。1、干熱滅菌火焰滅菌微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其它金屬用具等，可直接在酒精燈火焰上灼燒進(jìn)行滅菌。這種方法滅菌迅速?gòu)氐?。此外，接種過(guò)程中，試管或三角瓶口等，也

47、可通過(guò)火焰灼燒滅菌。干熱滅菌用干燥熱空氣殺死微生物的方法稱為干熱滅菌。通常將滅菌物品置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在160oC170oC加熱12h。滅菌時(shí)間可根據(jù)滅菌物品性質(zhì)與體積作適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到滅菌目的。玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)皿等）、金屬用具等，凡不適于用其它方法滅菌而又能耐溫的物品都可用此法滅菌。但是，培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。干熱滅菌箱的構(gòu)造如圖4-2所示。 干熱滅菌操作步驟圖 4-2 干熱滅菌箱（自趙斌）1. 溫度計(jì)與排氣孔;2.溫度調(diào)節(jié)旋扭;3.指示燈;4.溫度調(diào)節(jié)器;5.鼓風(fēng)扭裝箱：將準(zhǔn)備滅菌的玻璃器材洗滌干凈、晾干，用錫箔紙包裹好或放入滅菌專用的鐵盒（或鋁盒）內(nèi)，放入干

48、熱滅菌箱，關(guān)好箱門(mén)。滅菌：接通電源，打開(kāi)干熱滅菌箱排氣孔，待溫度升至80oC100oC時(shí)關(guān)閉排氣孔。繼續(xù)升溫至160oC170oC時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)。恒溫12h。滅菌結(jié)束后，斷開(kāi)電源，自然降溫至60oC，打開(kāi)干熱滅菌箱門(mén)，取出物品放置備用。 注意事項(xiàng)滅菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干熱滅菌中容易炸裂。滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升。滅菌物品不能直接放在電烘箱底板上，以防止包裝紙或棉花被烤焦。滅菌溫度恒定在160170 oC為宜。溫度超過(guò)180 oC，棉花、報(bào)紙會(huì)燒焦甚至燃燒。降溫時(shí)，需待溫度自然降至60oC以下才能打開(kāi)箱門(mén)取出物品，以免因溫度過(guò)高而驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂

49、。2、濕熱滅菌濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸氣滅菌。在相同溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好的原因是：熱蒸氣對(duì)細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)。水分子的存在有助于破壞維護(hù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其它相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比（表41）；熱蒸汽熱空氣穿透力強(qiáng)，能更加有效地殺滅微生物；蒸汽存在潛熱，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時(shí)可放出大量，故可迅速提高滅菌物體溫度。多數(shù)細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在60oC左右處理15min后即可殺后，酵母菌和真菌的孢子要耐熱些，要用80oC以上的溫度處理才能殺死，而細(xì)菌的芽胞更耐熱，一般要在120oC下處理15min才能殺死。濕熱滅菌常用的方法

50、有常壓蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌。表41蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度的關(guān)系蛋白質(zhì)含水量/% 蛋白質(zhì)凝固點(diǎn)/oC50 5625 748018 80906 145常壓蒸汽滅菌（1）常壓蒸汽滅菌方法 常壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌的方法之一，在不能密閉的容器里產(chǎn)生蒸汽進(jìn)行滅菌。在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下，常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌方法。此外，不宜用高壓蒸煮的物質(zhì)，如糖液、牛奶、明膠等，可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法所用的滅菌器有阿諾氏（Aruokd）滅菌器或特制的蒸鍋，也可用普通的蒸籠。由于常壓蒸汽的溫度不超過(guò)100oC，壓力為常壓，大多數(shù)微物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞能被殺死，但芽胞細(xì)菌卻不能在短時(shí)間內(nèi)死亡，因此必須采取間

51、歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法，以殺死芽胞細(xì)菌，達(dá)到完全滅菌。巴氏消毒：是用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中的無(wú)芽胞病原菌，如牛奶中的結(jié)核分枝桿菌或沙門(mén)氏菌，而又不影響其特有風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法，具體的處理溫度和時(shí)間各有不同，一般在6085oC下處理1530min。具體的方法可分兩類，第一類是較老式的，稱為低溫維持法，例如在63oC下保持30min可進(jìn)行牛奶消毒；另一類是較新式的，稱為高溫快速，用于牛奶消毒時(shí)只要在85oC下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能殺滅引起Q熱的病原體伯氏考克斯氏體（一種立克次氏體）。間歇滅菌法：又稱分段滅菌法

52、。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在100oC下蒸煮3060min，以殺死其中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或2030oC下保溫過(guò)夜，誘導(dǎo)殘留的芽胞萌發(fā)，第二天再以同法蒸煮和保溫過(guò)夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。例如，培養(yǎng)硫細(xì)菌含硫培養(yǎng)基就應(yīng)用間歇滅菌法滅菌，因?yàn)槠渲械脑亓蚪?jīng)常規(guī)的高壓滅菌（121oC）后會(huì)發(fā)生熔化，而在100oC的溫度下則呈結(jié)晶狀。蒸汽持續(xù)滅菌法：微生物制品土法生產(chǎn)或食用菌菌種制備時(shí)常用這種方法。在容量較大的蒸鍋中進(jìn)行。從蒸汽大量產(chǎn)生開(kāi)始，繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽，待鍋內(nèi)溫度達(dá)到100oC時(shí)，持續(xù)加熱36h，殺死絕大部分芽胞和全

53、部營(yíng)養(yǎng)體，達(dá)到滅菌目的。以上三種方法通過(guò)是在無(wú)高壓蒸汽滅菌條件的地方（如農(nóng)村）使用。（2）滅菌過(guò)程中注意事項(xiàng)使用間歇法或持續(xù)法滅菌時(shí)必須在滅菌物里外都達(dá)到100oC后，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，此時(shí)鍋?lái)斏蠎?yīng)有大量蒸汽冒出。為利于蒸汽穿透滅菌物，鍋內(nèi)或蒸籠上堆放物品不宜過(guò)滿過(guò)擠，應(yīng)留有空隙。固體曲料大量滅菌時(shí)，每袋以1.52.0kg為宜，料袋在鍋內(nèi)用蓖子分層隔開(kāi)，不能堆壓在一起?；鸫笏悴拍鼙ＷC汽足，蒸鍋里應(yīng)先把水加足。一次持續(xù)滅菌時(shí)，如鍋內(nèi)盛水量不能維持到底，應(yīng)在蒸鍋側(cè)面安裝加水口，以便在蒸煮過(guò)程中添水。添水應(yīng)用開(kāi)水，以防驟然降溫。間歇法滅菌時(shí)應(yīng)在每次加熱后，迅速降溫，然后在室溫放置24h，再第二次加

54、熱。如果降溫慢，往往使未殺死的雜菌大量滋長(zhǎng)，反而導(dǎo)致滅菌物變質(zhì)，特別是固體曲料包裝過(guò)大時(shí)，靠近中心部分更易發(fā)生這種情況。從使用效果看，分裝試管、三角瓶或其它容器的培養(yǎng)基，因其體積小，透熱快，以用間歇法為佳。固體曲料，因其包裝較大，透熱慢，用間歇法容易滋生雜菌變質(zhì)或者水分蒸發(fā)過(guò)多，曲料變得不新鮮，影響培養(yǎng)效果，因此使用一次性持續(xù)滅菌法較好。高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌法是微生物學(xué)研究和教學(xué)中應(yīng)用最廣、效果最好的濕熱滅菌方法。 滅菌原理高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器（鍋）中進(jìn)行的，其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會(huì)使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而溫度也隨之上升到100oC以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達(dá)到121oC（壓力為0.1MPa），時(shí)間維持1530min。也可采用在較低的溫度（115oC，即0.075MPa）下維持35min的方法。為什么比濕熱滅菌的工藝指標(biāo)低？此法適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物品的滅菌。蒸汽壓力與溫度的關(guān)系如表42所示。表42蒸汽壓力與溫度的類系蒸汽壓力（表壓）蒸汽溫度kg/cm2MPaoCoF0.000.0