分子生物研究生考試相關(guān)內(nèi)容整理

1、一 腫瘤相關(guān)基因1、從分子生物學(xué)的角度，惡性腫瘤可視為基因的疾病。某些染色體上的損傷致使基因突變的結(jié)果，導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)、缺乏分化而異常增生，并可侵犯正常組織和器官，最終可以擴(kuò)散到全身。腫瘤的發(fā)生多因素,多基因,多階段,多途徑。2、直接致癌物指直接暴露于細(xì)胞和機(jī)體便可致癌的因素或分子。3、前致癌物指需經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化方具有致癌活性因素或分子4、癌基因：是指細(xì)胞內(nèi)或病毒內(nèi)存在的能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的基因它的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異?？梢鸺?xì)胞癌變。細(xì)胞癌基因激活的方式（點(diǎn)突變、基因易位、基因擴(kuò)增、啟動(dòng)子的插入、去甲基化）5、惡性腫瘤中則是糖酵解抑制有氧氧化，Warburg稱為效應(yīng)。腫瘤無(wú)論在有氧、無(wú)氧的條件

2、下均表現(xiàn)為糖酵解活躍，因此與之相關(guān)的酶活性均增強(qiáng)。6、腫瘤細(xì)胞膜發(fā)生的改變：細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)是腫瘤的特征；植物凝集素引起的凝集性增加使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)接觸抑制；細(xì)胞膜粘附性降低有利于癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；膜表面負(fù)電荷增加；糖蛋白中的糖鏈改變是腫瘤常見(jiàn)的變化；膜糖脂組成發(fā)生變化；惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞膜上存在腫瘤纖溶酶。7、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的三個(gè)過(guò)程：腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、結(jié)合。腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶的降解。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至被水解的基質(zhì)區(qū)進(jìn)一步生長(zhǎng)、擴(kuò)散。二基因診斷與基因治療1、基因診斷：利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)基因及基因表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是DNA、RNA，也

3、可以是蛋白質(zhì)或者多肽。2、southern blotting：即將待測(cè)DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已知DNA探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。提取DNA限制性內(nèi)切酶消化DNA,以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段凝膠電泳分離變性處理DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合將標(biāo)記的探針與膜上DNA片段雜交分析雜交信號(hào)。4、northern blotting：RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過(guò)分子雜交檢測(cè)特定的RNA分子的含量與大小。14)Southernblot：DNA印跡雜交，指利用具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過(guò)程是高度特異的。由于核酸分子

4、的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜，此即DNA印跡雜交。Northernblot：RNA印跡雜交，首先通過(guò)電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過(guò)與特定基因互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交來(lái)檢測(cè)目的片段。Westernblot：蛋白質(zhì)印跡。通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。5、原位雜交：是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸序列進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本

5、或組織標(biāo)本上進(jìn)行。6、熒光原位雜交：是原位雜交技術(shù)大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記（間接或直接）而得名；基本原理用熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)可在不改變被分析對(duì)象（即維持其原位）的前提下對(duì)靶核酸進(jìn)行分析。7、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）: 是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA的短時(shí)間內(nèi)大幅增加。8、反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR，LTR由U3、R和U5三部分組成,U3在內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子,U3和U5兩端分別有病毒整合序列

6、,在R內(nèi)還有ployA加尾信號(hào)。病毒具有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，9、廣義的基因治療：外源正?；?qū)氩∽兗?xì)胞，產(chǎn)生正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物以補(bǔ)充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)；采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的基因；將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物；向功能異常的細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來(lái)不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。三、分子生物學(xué)技術(shù)1、核酸分子雜交技術(shù)：是在DNA變性和復(fù)性的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù). 其原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形成雙鏈(堿基對(duì)之間非共價(jià)健形成穩(wěn)定的雙鏈).2、核酸探針：是指用放

7、射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測(cè)的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。3、人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針?？珊铣蓡捂溙结?，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配4、篩選寡核苷酸針的原則：長(zhǎng)1850bp，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。堿基成分：G+C含量為40%60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。探針?lè)肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)

8、夾”狀結(jié)構(gòu)。避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如-CCCCC-。探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源。5、western blotting的原理：Western Blot被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水

9、平的表達(dá)。四、電泳1、電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。2、電泳分離技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。3、電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)于一個(gè)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲現(xiàn)象。4、不連續(xù)凝膠電泳：是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑的電泳方式，可提高分辨率、有濃縮效應(yīng)。5、 影響電泳的主要因素有哪些？顆粒自身結(jié)構(gòu)因素，顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快，反之則泳動(dòng)速度慢。外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度 ，溶液的pH值，溶液的離子強(qiáng)度，電滲現(xiàn)象，溫度的影響，支持物的影響（介質(zhì)粘度）6、 如何制備聚丙烯酰胺凝膠？聚丙烯酰胺凝膠是

10、由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。7、 不連續(xù)電泳樣品壓縮成層原理。緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性：電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開(kāi)始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，當(dāng)二者速度相等時(shí)，形成一個(gè)不斷向正極移動(dòng)的界面，

11、蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮。凝膠孔徑的不連續(xù)性：在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中阻力小，速度快，進(jìn)小孔膠時(shí)，阻力大，速度慢，在兩膠交界處，因遷移受阻而被壓縮。8、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS和巰基乙醇后:巰基乙醇使蛋白質(zhì)二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于蛋白質(zhì)的分子量。9、 采用電泳技術(shù)如何測(cè)定蛋白質(zhì)分子量？如何測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)？SDS-聚丙烯酰凝膠電泳和等電點(diǎn)聚焦電泳（電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成：由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH

12、梯度。 Proteins進(jìn)入時(shí)，不同的P移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上而停止，從而使不同等電點(diǎn)的P得以分離。）五PCR1、 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 又稱體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，將目的基因或某一DNA片段于體外快速擴(kuò)增至百萬(wàn)倍,千萬(wàn)倍。特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、 重復(fù)性好、易自動(dòng)化等2、 PCR技術(shù)的基本原理：PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1): 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右后，雙鏈DNA變性為單鏈DNA ；2): 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3): 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqD

13、NA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需14分鐘， 23小時(shí)就能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。3、設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：1): 引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。2): PCR產(chǎn)物： 200-500bp，可擴(kuò)增長(zhǎng)至30kb的片段。3): 引物堿基：G+C含量以40-60%，G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免4個(gè)單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。4

14、): 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體。 5): 引物3端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。6): 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性. 7): 引物5端加上合適的酶切位點(diǎn)，這對(duì)被擴(kuò)增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好處。在算Tm值時(shí)不算, 但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們 8): 使用兼并引物時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用 較高的引物濃度(1uM-3uM) 9): 最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5, Oligo6, DN

15、Astar, Vector NTI, Online desgin et al.4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理：指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。5、Ct閾限循環(huán)值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度到達(dá)設(shè)定的檢測(cè)域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。6、熒光探針：探針退火溫度應(yīng)比引物高510，一般情況下探針長(zhǎng)度小于30bp，5末端不能是G，G可能會(huì)淬滅熒光，選擇GC含量在3080的目標(biāo)序列設(shè)探針，將探針置于G和C含量高的區(qū)域，引物盡量靠近探針，先合成引物

16、，用SYBR Green I進(jìn)行篩選，確定引物特性后再合成探針。7、 理想的 real-time PCR體系應(yīng)該具備的特點(diǎn): PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高， 理想的PCR效率（90105），理想的重復(fù)性， 較寬的動(dòng)態(tài)范圍（9個(gè)數(shù)量級(jí)）靈敏度每個(gè)特性都可以通過(guò)優(yōu)化取得，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證端粒酶的工作原理答：原核生物的染色體是環(huán)狀的，其5最末端崗崎片段的RNA引物被降解后可借助另半圈DNA鏈向前延伸來(lái)填補(bǔ)。但真核生物線性DNA在復(fù)制后，不能填補(bǔ)5末端的空缺，從而會(huì)使5末端序列因此而縮短。真核生物通過(guò)形成端粒結(jié)構(gòu)來(lái)解決此問(wèn)題，復(fù)制使端粒5末端縮短，而端粒酶可外加重復(fù)單位到5末端上，結(jié)果便是維持端粒一定的長(zhǎng)度

17、。端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，它以所含的RNA引物為模板來(lái)合成DNA端粒結(jié)構(gòu)。端粒酶可結(jié)合到端粒的3末端上，RNA引物的5末端識(shí)別DNA的3末端堿基并相互配對(duì)，以RNA鏈為模板使DNA鏈延伸，合成一個(gè)重復(fù)單位（TTTAGGG）后，酶再向前移動(dòng)一個(gè)單位。合成結(jié)束后，端粒的3單鏈末端折回作為引物，合成其互補(bǔ)鏈。六、蛋白質(zhì)1、肽鍵：一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的，羧基脫水縮合所形成的鍵 2、肽：氨基酸通過(guò)肽鍵相連形成的化合物 3、肽鏈：指多個(gè)氨基酸以肽鍵相連形成的一條長(zhǎng)鏈。4、氨基酸殘基：構(gòu)成肽鏈的一個(gè)個(gè)氨基酸單位因?yàn)閰⑴c肽鍵的形成已不再是原來(lái)完整的分子。5、主鏈與側(cè)鏈（backbone

18、and side chain）：多肽鏈中肽鍵與-碳原子形成一條骨架，稱為主鏈；氨基酸的側(cè)鏈R基團(tuán)在此骨架上向外延伸，形成肽鏈的側(cè)鏈。6、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu) 指多肽鏈中氨基酸的排列順序，穩(wěn)定因素：肽鍵7、構(gòu)象(conformation)：指構(gòu)成分子的原子和基團(tuán)因?yàn)榛瘜W(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)而形成在三維空間上不同的排布、走向。構(gòu)象的改變不涉及共價(jià)鍵的破裂，僅涉及氫鍵、疏水鍵等次級(jí)鍵的變化。 8、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)定義：指多肽鏈主鏈骨架的局部肽段上形成的有規(guī)則或無(wú)規(guī)則的構(gòu)象,并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。 穩(wěn)定因素：氫鍵，基本類型：-螺旋和-折疊（有規(guī)則）-轉(zhuǎn)角和環(huán)（部分有規(guī)則）無(wú)序結(jié)構(gòu)9、肽平面：由于肽鍵帶有部分雙鍵的

19、性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)，這樣促使構(gòu)成肽鍵的C、H、O、N四個(gè)原子和與之相連的兩個(gè)C都處于同一個(gè)平面，這個(gè)平面即肽平面。 10、 二面角：?jiǎn)捂I的旋轉(zhuǎn)角度，二面角決定了兩個(gè)相鄰肽平面的空間相對(duì)位置 11、 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置，也就是整條肽鏈的所有原子在三維空間的排布位置。 穩(wěn)定因素：側(cè)鏈R基團(tuán)之間相互作用形成的各種非共價(jià)鍵，包括疏水鍵、氫鍵、離子鍵和范德華力等，如肌紅蛋白。12、 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩條或兩條以上的具有蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，形成亞基間特定空間排布及相互作用的多聚體。穩(wěn)定因素：主要靠氫鍵和離子鍵，舉例：血紅蛋白（hemogl

20、obin,Hb）13、別構(gòu)效應(yīng)：指蛋白質(zhì)與配基結(jié)合后能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的生物活性的現(xiàn)象。血紅蛋白是至今了解得最清楚的一個(gè)別構(gòu)蛋白質(zhì)，有兩種能夠互變的構(gòu)象，緊密型T和松弛型R。別構(gòu)效應(yīng)的機(jī)理：正協(xié)同效應(yīng)：當(dāng)?shù)谝粋€(gè)亞基與配體結(jié)合后，可促進(jìn)下一個(gè)亞基與配體的結(jié)合，稱為正協(xié)同效應(yīng)。 14、蛋白質(zhì)超二級(jí)結(jié)構(gòu)：相鄰的幾個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用形成有規(guī)則的組合體，又稱基序，如，15、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域: 分子量大的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)?？煞指畛?個(gè)和數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域，如平行/型 反平行-型 全-型 小的不規(guī)則結(jié)構(gòu) 16、導(dǎo)肽（leader sequence）的性

21、質(zhì)：富含帶正電荷的堿性氨基酸，引導(dǎo)肽中缺少或不含帶負(fù)電荷的酸性氨基酸，帶羥基的氨基酸如Ser和Thr在引導(dǎo)肽中的含量也比較豐富，可形成一種帶正電的兩性-螺旋結(jié)構(gòu)，一側(cè)是帶正電的親水表面，另一側(cè)為疏水性表面。17、導(dǎo)肽運(yùn)輸途徑的具體過(guò)程：前體蛋白首先與外膜表面受體結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移至TOM 復(fù)合物；前體蛋白以去折疊狀態(tài)并以N 端先通過(guò)的方式穿過(guò)TOM 復(fù)合物的跨膜通道；在TIM復(fù)合物的協(xié)同作用下，出現(xiàn)在膜間隙側(cè)的前體蛋白被牽引至TIM復(fù)合物表面；在線粒體內(nèi)膜膜電位和mtHsp70 水解ATP 提供的能量驅(qū)動(dòng)下，前體蛋白穿過(guò)TIM跨膜通道，最終被mtHsp70 牽引進(jìn)線粒體基質(zhì)。在基質(zhì)中，前體蛋白被線

22、粒體加工肽酶水解剪切掉前導(dǎo)肽后折疊形成成熟的蛋白。18、分子伴侶(chaperone),是細(xì)胞內(nèi) 的一類保守蛋白質(zhì) ，可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊; 從功能上定義的，凡具有 輔助蛋白折疊功能的蛋白都是分子伴侶，它們的結(jié)構(gòu)可以完全不同。19、分子伴侶作用：通過(guò)催化的或非催化的方式，加速或減緩蛋白質(zhì)組裝過(guò)程；傳遞蛋白質(zhì)組裝所需要的空間信息；抑制組裝過(guò)程中不正確的副反應(yīng)；幫助正確的 “非共價(jià)組裝”，排除共價(jià)修飾酶；不僅幫助新生肽鏈的折疊，還幫助新生肽鏈成熟為活性蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜定位、亞基組裝等。20、分子伴侶的作用特點(diǎn)：參與催化、介導(dǎo)其他多肽鏈或寡聚體蛋白質(zhì)分子的

23、折疊與組裝，但不是蛋白質(zhì)最終結(jié)構(gòu)的一部分;與靶蛋白的結(jié)合不具高度專一性，同一伴侶分子可促進(jìn)多種氨基酸序列不同的多肽鏈折疊;只是分子折疊的協(xié)助者，本身并不含正確折疊所必須的構(gòu)象信息，而是通過(guò)阻止非天然多肽內(nèi)部或相互間的不正確作用而發(fā)揮效能。熱休克蛋白21、脂蛋白：血脂與蛋白質(zhì)的結(jié)合，由蛋白質(zhì)、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其脂組成22、分泌蛋白：是指在細(xì)胞內(nèi)合成后，分泌到細(xì)胞外起作用的的蛋白質(zhì)，在核糖體上合成的分泌蛋白，要經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，而不是直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。信號(hào)肽是存在于所有分泌性蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)N端的共同序列，與多肽鏈的識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密切相關(guān)。七、DNA序列的測(cè)定1、雙脫氧鏈終止法：在一般D

24、NA復(fù)制中加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因?yàn)樗c普通dNTP不同，在脫氧核糖的3位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。原理是采用核苷酸鏈終止劑2，3，-雙脫氧核苷酸終止DNA的延長(zhǎng)。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂鍵所需要的3-OH，一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。根據(jù)堿基配對(duì)原則，每當(dāng)DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長(zhǎng)的DNA鏈中時(shí)，就有兩種可能性，一是參入ddNTP,結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長(zhǎng)的終止；二是參入dNTP,使DNA鏈仍可繼續(xù)延長(zhǎng)，直至參入下一個(gè)ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不一的DNA片段。

25、方法是分成四組分別為ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反應(yīng)后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出DNA序列。2、DNA芯片技術(shù)：是指通過(guò)微加工技術(shù)將大量的DNA以預(yù)先設(shè)計(jì)的排列方式有序地固定在載體表面，形成儲(chǔ)存有大量信息的DNA陣列。該陣列與標(biāo)記的核酸雜交后，能在短時(shí)間快速，準(zhǔn)確地獲取大量信息。 DNA芯片制作方式： 1): 在固相支持物上直接合成探針 2): 在固定面上固定已合成的探針 雜交信號(hào)的檢測(cè):常用: 熒光信號(hào)，放射性標(biāo)記技術(shù)。檢測(cè)器及處理器由激光共聚焦顯微鏡及電腦組成，經(jīng)電腦應(yīng)用特定軟件處理可得出DNA的序列及其變化情況。3、 DNA芯片技術(shù)基礎(chǔ): 需要大量已知準(zhǔn)確的DNA

26、、cDNA片斷信息，高密度芯片制作的精密機(jī)械系統(tǒng)和操作工藝，雜交的微弱信號(hào)的檢出裝置，對(duì)雜交信號(hào)及相關(guān)信息、數(shù)據(jù)的大規(guī)模收集, 和分析的能力。特點(diǎn)：高通量、大規(guī)模、平型性等4、 DNA克?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA 。 5、 基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱

27、重組DNA工藝學(xué)。目的： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）6、 基因載體：能攜帶目的基因，具有自我復(fù)制能力，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)的一些DNA分子。質(zhì)粒DNA,噬菌體DNA，病毒DNA。7、 載體的選擇：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。8、 重組DNA的技術(shù)基本原理：目的基因的獲取，克隆載體的選擇和構(gòu)建，外源基因與載體的連接，DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，重組體的篩選，克隆基因的表達(dá) 。9、基因敲除：利用DNA體外重組技術(shù)

28、構(gòu)建基因敲除的打靶載體，然后根據(jù)同源重組的原理將打靶載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，使特定基因活性喪失。10、基因沉默技術(shù)的目的是對(duì)具有特定序列的基因表達(dá)進(jìn)行特異的抑制。11、RNA干擾(RNAi) ，當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（dsRNA)時(shí)，誘導(dǎo)該同源mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。此過(guò)程發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默12、RNAi 的作用特點(diǎn)：“共抑制”: RNAi 使外源基因同源的內(nèi)源基因沉默；效率高: 效率比單純反義或正義RNA 的抑制效率高100fold, 使靶基因表達(dá)降到很低水平甚至完全“剔除” (knockdown) 。它比基因敲除技術(shù)(knoc

29、kout)更為便捷。特異高: RNAi能特異性降解mRNA單個(gè)堿基的改變即可使RNAi失效。穿透能力強(qiáng): RNAi能在不同的細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞。穩(wěn)定性高:此機(jī)制可能是siRNA與某種保護(hù)性蛋白結(jié)合,從而使其具有相對(duì)的穩(wěn)定性; RNAi具有一定的可遺傳性。13、RNAi 的作用機(jī)制1): 在細(xì)胞內(nèi),雙鏈RNA(dsRNA)由核酸酶(RNase) -Dicer 在ATP的參與下被處理為21個(gè)23個(gè)堿基的小RNA，即小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA是由19個(gè)21個(gè)堿基配對(duì)形成的雙鏈, 并在其3末端有兩個(gè)游離未配對(duì)的核苷酸。siRNA 是RNAi 作用發(fā)

30、生的重要中間分子；雙鏈的兩端各有23個(gè)突出的非配對(duì)的3堿基；兩條單鏈末端為5端磷酸和3端羥基。這些是細(xì)胞賴以區(qū)分真正的siRNA和其他雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2): siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端切割mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA

31、不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA， 可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。八、基因組學(xué)1、基因組學(xué)：指在遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來(lái)的學(xué)科，主要研究生物體全基因組的分子特征。1、 遺傳圖譜：利用人類基因組的一些特殊位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因組分區(qū)，即通過(guò)計(jì)算遺傳標(biāo)記的重組率，以重組率的大小反應(yīng)遺傳標(biāo)記間的相對(duì)距離繪制遺傳圖譜。標(biāo)記包括：限制性片段長(zhǎng)度多型性，簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)

32、度多態(tài)性，單核甘酸多態(tài)性。2、 物理圖譜：利用已知序列的DNA片段為基因組分區(qū)，標(biāo)記有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，基因，序列標(biāo)簽位點(diǎn)。3、 轉(zhuǎn)錄圖譜：是指轉(zhuǎn)錄體或其反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA在基因組中的位置，又稱基因圖譜或表達(dá)圖譜，根據(jù)組織細(xì)胞中可表達(dá)片段標(biāo)簽繪制的圖譜，是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA或EST的部分cDNA片段作為探針與基因組DNA進(jìn)行分子雜交，標(biāo)記轉(zhuǎn)錄基因，繪制出可表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄圖。4、 序列圖譜：是人類基因組的全部核苷酸的排列順序，是將人類基因組DNA分段克隆，然后組件進(jìn)行序列分析，在按標(biāo)志將各重疊片段拼接，構(gòu)成完整的基因組DNA序列圖。5、 一代測(cè)序：DNA鏈末端合成終止法，6、

33、 二代測(cè)序：新一代的測(cè)序技術(shù)、深度測(cè)序、高通量測(cè)序技術(shù)，一次可完成數(shù)數(shù)萬(wàn)到百萬(wàn)條的DNA分子的序列測(cè)定，原理是合成法測(cè)序、連接法測(cè)序，不需要大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行DNA模板擴(kuò)增，不需要凝膠分離。7、 三代測(cè)序：?jiǎn)畏肿訜晒鉁y(cè)序，dNTP用四種熒光標(biāo)記，顯微鏡下實(shí)時(shí)記錄熒光的變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的dNTP摻入DNA鏈的時(shí)候，熒光就能檢測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的dNTP不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，在熒光被切除后，合成的鏈和天然的鏈完全一致。納米孔測(cè)序，是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序，由于納米孔的直徑非常小，僅允

34、許單個(gè)核酸聚合酶通過(guò)，而ATCG單個(gè)堿基的帶點(diǎn)性質(zhì)不一樣，通過(guò)電信號(hào)的差異就能檢測(cè)出通過(guò)的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。8、 第三代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)：速度快，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，精度高，體現(xiàn)了DNA聚合酶自身的特點(diǎn)，可直接測(cè)量RNA的序列，直接測(cè)甲基化的DNA的序列。九、蛋白組學(xué)1、蛋白質(zhì)組學(xué)：大規(guī)模水平上研究蛋白的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白的相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于生理、病理等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。它采用大規(guī)模、高通量、高靈敏度的技術(shù)手段，通過(guò)全局性研究基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)在不同時(shí)間與空間的表達(dá)譜和功能譜，全景式地揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)。2、主要技術(shù)路線：樣

35、品的選擇和處理：盡可能采用簡(jiǎn)單的方法處理，以免蛋白質(zhì)的丟失；細(xì)胞和組織樣品的制備盡可能減少蛋白質(zhì)的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以防止蛋白的降解；樣品裂解液應(yīng)該新鮮制備，已制備好的樣品不要反復(fù)凍溶，加入尿素后加溫小于37，因?yàn)榧訜岷竽蛩胤纸猱a(chǎn)生的可對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸甲酰化修飾，氰酸鹽引起電荷改變。蛋白質(zhì)的分離：免疫親和細(xì)胞分離技術(shù)，利用單克隆抗體特異性結(jié)合細(xì)胞表面抗原的親和細(xì)胞分離技術(shù)；激光捕獲顯微切割技術(shù)，是在不破壞組織結(jié)構(gòu)，保存要捕獲的細(xì)胞和其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標(biāo)細(xì)胞 ，通常用于從組織中精確地分離一個(gè)單一的細(xì)胞。LCM的基本原理是通過(guò)一低能紅外激光脈沖激活熱塑膜乙烯乙酸乙烯酯膜（其最大吸收峰接近紅外激光波長(zhǎng)）