微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告一

1、北 方 民 族 大 學(xué)學(xué) 生 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告院（部） 生物科學(xué)與工程學(xué)院 姓 名 學(xué) 號 專 業(yè) 生物工程 班 級 同組人員 課程名稱 微生物學(xué)類實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)名稱 產(chǎn)酶微生物的分離、純化與選育 實(shí)驗(yàn)日期 2013.11 批閱日期 成 績 教師簽字 北方民族大學(xué)教務(wù)處制產(chǎn)酶微生物的分離、純化與選育實(shí)驗(yàn)意義：酶是生物體內(nèi)進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑，在生物體中已發(fā)現(xiàn)的酶有2500多種。由于酶促反應(yīng)的特異性強(qiáng)，反應(yīng)溫和，安全無毒，環(huán)境污染少，在洗滌劑、皮革、紡織、診斷、制藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。能由工業(yè)生產(chǎn)的50多種酶制劑蛋白酶、淀粉酶等，大部分是由霉菌、細(xì)菌、鏈霉菌和酵母菌生產(chǎn)的。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)會從

2、自然界中分離產(chǎn)酶微生物的方法，軍中的純化技術(shù)及其高產(chǎn)菌的選育技術(shù)。1. 蛋白酶產(chǎn)生菌的分離與純化1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)從自然界中分離蛋白酶產(chǎn)生菌并純化。1.2實(shí)驗(yàn)原理許多細(xì)菌和霉菌產(chǎn)生蛋白酶，細(xì)菌中的芽孢桿菌是常見的蛋白酶產(chǎn)生菌。本實(shí)驗(yàn)將土壤樣品（或其他樣品）懸液加熱處理，殺死非芽孢細(xì)菌及其他微生物后進(jìn)行劃線分離得到芽孢桿菌，將其接種到酪蛋白平板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)酪蛋白平板的水解圈作初篩。也可直接將細(xì)菌或霉菌接種到酪蛋白平板進(jìn)行培養(yǎng)，分離篩選其他蛋白酶產(chǎn)生菌。1.3實(shí)驗(yàn)儀器與材料土壤樣品或其他富含蛋白質(zhì)的樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、酪蛋白平板、無菌水（帶玻璃珠）、芽孢染色液；顯微鏡、恒溫水浴鍋、酒

3、精燈、接種針、游標(biāo)卡尺、無菌移液管、無菌試管、量筒等。1.4實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.4.1配制酪素培養(yǎng)基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，瓊脂 2.0g，蒸餾水100mL左右， 調(diào)節(jié)pH 7.6-8.0。1.4.1.1配制方法：稱取酪素1g，先用少量2%NaOH潤濕，玻璃棒攪動，再加適量的蒸餾水，在沸水浴中加熱并攪拌，至完全溶解，補(bǔ)足水量至100mL，加入其他成分，調(diào)整pH值，滅菌備用。1.4.2配制土壤樣品：1） 采集土壤樣品，用無菌水制備1：10土壤懸液。2） 取1：10土壤懸液5ml，然后將懸液按10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋，注入試管中。3）將這些試管放入

4、75-80 水浴中熱處理10 min，以殺死非芽孢細(xì)菌。1.4.3滅菌與接種：1） 將培養(yǎng)基滅菌處理。2） 取加熱處理過的土壤懸液100-200 L，涂布接種到酪素培養(yǎng)基平板，將平板倒置，于30-32 培養(yǎng)24-48 h。1.4.4.蛋白酶產(chǎn)生菌的純化：1）根據(jù)酪蛋白平板的水解圈作初篩，挑選出單菌落的蛋白酶產(chǎn)生菌。2）將挑選出的單菌落用平板劃線法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，然后將平板倒置放于培養(yǎng)箱中2448h。1.4.5芽孢桿菌的染色判斷1）挑去菌落涂片固定。2）滴加12滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液4

5、）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無色。6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。1.4.6蛋白酶產(chǎn)生菌的保存培養(yǎng)：1）用斜面劃線法，取純化鑒定后的菌種接種于斜面上，放于培養(yǎng)箱中2448h。2） 將培養(yǎng)后的菌種置于冰箱中保存。1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 在含酪蛋白的平板上，產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌可形成蛋白質(zhì)水解圈。自然界中分離的微生物各菌株間產(chǎn)蛋白酶活力有很大差異，有些芽孢桿菌酶活力超過4000 U/mL。1） 描述你所分離的蛋白酶產(chǎn)生菌的菌落特征和個(gè)體形態(tài)特征；答：第一組：A:原液培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大面積菌落，難以挑出所需單一菌落； B:10-1培

6、養(yǎng)基表面菌落較多，但未發(fā)現(xiàn)與所需菌落相關(guān)特征； C:10-4培養(yǎng)基表面基本未出現(xiàn)菌落： D:10-2、10-3均發(fā)現(xiàn)與所需菌落特征相符的菌落，繼續(xù)培養(yǎng)待進(jìn)一步純化。 第二組：A：原液培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大面積菌落，難以區(qū)分 B:10-3培養(yǎng)基表面基本未出現(xiàn)菌落 C:10-4培養(yǎng)基表面基本未出現(xiàn)菌落： D:10-1、10-2培養(yǎng)基表面均發(fā)現(xiàn)與所需菌落特征相符的菌落，繼續(xù)培養(yǎng)待進(jìn)一步純化2） 報(bào)告你所分離的蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩（水解圈與菌苔直徑的比值）結(jié)果。 答：求的平均HC值=1.71.6注意事項(xiàng) 1）土壤懸液加熱處理的溫度和時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)確控制； 2）點(diǎn)接含酪蛋白的平板時(shí)，接種量及接種面積要基本相同。1.7

7、分析與討論 在酪蛋白平板上水解圈與菌落直徑比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，對初篩選出的水解圈與菌落直徑比值大的菌落要進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)一步對發(fā)酵液進(jìn)行酶活力測定。1.8思考題 1）對所篩選的菌株如何進(jìn)一步提高酶活力？請寫出設(shè)想和方案；答：選用蛋白酶產(chǎn)量較高的原始菌種，擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用低濃度的菌懸液，進(jìn)行紫外線時(shí)間梯度照射，選取一個(gè)突變率較高，成活率也較高的時(shí)間，大批量的進(jìn)行紫外照射誘變，然后在明膠固體培養(yǎng)基平板上篩選水解圈較大的菌株接種，培養(yǎng)后測定水解酶活性，進(jìn)一步篩選出高產(chǎn)菌株。2） 蛋白酶有哪些方面的應(yīng)用。答：蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。微生物蛋白酶，主要由

8、霉菌、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。2.產(chǎn)酶微生物菌種的選育生物的遺傳信息的改變是通過基因突變、基因重組和基因轉(zhuǎn)移來進(jìn)行的?；蛲蛔?，又稱點(diǎn)突變（point mutation），包括自發(fā)突變和誘發(fā)突變，前者是未經(jīng)人為施加誘變劑處理而發(fā)生的突變，后者是經(jīng)人為施加誘變劑處理而獲得的突變。兩種突變都是由于一個(gè)或幾個(gè)堿基的增加、缺失或置換而引起的，因此本質(zhì)相同，不同的只是誘發(fā)突變的頻率比自發(fā)突變的頻率要高得多。這一部分的實(shí)驗(yàn)是以紫外線為例介紹了物理因素對微生物的誘變作用。本實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生將篩選出的蛋白酶的產(chǎn)生菌株作為出發(fā)菌株通過紫外線即物理因素對微生物的誘變作用，對以上菌株進(jìn)行選育工作。特以蛋白酶產(chǎn)生菌

9、株作為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線的誘變作用，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，可初步確定蛋白酶的高產(chǎn)菌株為例來介紹本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過實(shí)驗(yàn)觀察紫外線和亞硝基胍等理化因素對微生物的誘變效應(yīng)，并掌握基本方法。2.2 實(shí)驗(yàn)原理基因突變可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。許多物理因素、化學(xué)因素和生物因素對微生物都有誘變作用，這些能使突變率提高到自發(fā)突變水平以上的因素稱為誘變劑。紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素。它的主要作用是使DNA雙鏈之間或同一條鏈上兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶間形成二聚體，阻礙雙鏈的分開、復(fù)制和堿基的正常配對，從而引起突變。紫外線照射引起的DNA損傷，可由光復(fù)活酶的作用進(jìn)行修復(fù)，使胸腺嘧

10、啶二聚體解開恢復(fù)原狀。因此，為了避免光復(fù)活，用紫外線照射處理以及處理后的操作應(yīng)在紅光下進(jìn)行，并且照射處理后的微生物放在暗處培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)分別以紫外線作為單因子誘變劑處理產(chǎn)生蛋白酶的菌株，根據(jù)試驗(yàn)菌誘變后在蛋白酶培養(yǎng)基上透明圈直徑的大小來指示誘變效應(yīng)。一般來說，透明圈越大，蛋白酶活性越強(qiáng)。2.3 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 篩選出的蛋白酶的產(chǎn)生菌株、酪素培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、無菌水試管等；1 mL無菌吸管、玻璃涂棒、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡、紫外線等（15W）、磁力攪拌器、臺式離心機(jī)、震蕩混合器等。2.4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟1）菌懸液的制備： 取培養(yǎng)48小時(shí)生長旺盛的出發(fā)菌株斜面4-5支，用10 ml 無菌生理鹽水將

11、菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。2）平板制作：將酪素培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時(shí)倒平板18套，凝固后待用。3）紫外線處理： 將紫外線燈開關(guān)打開，預(yù)熱約20分鐘。 取直徑6cm無菌平皿2套，分別加入上述調(diào)整好細(xì)胞濃度的菌懸液3ml，并放入一根無菌攪拌棒于平皿中。 將上述2套平皿先后置于磁力攪拌器上，打開皿蓋，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘和3分鐘。蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。4）稀釋：將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。5）涂

12、平板：取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對照。6）培養(yǎng)：將上述涂勻的平板，用報(bào)紙包好，置37培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。7）計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。8）觀察誘變效應(yīng)：將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5-6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與

13、對照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果1）將紫外線誘變結(jié)果填入下表；紫外線誘變結(jié)果稀釋倍數(shù)平均菌落處理時(shí)間 （數(shù)/皿）誘變劑 （min）10-4存活率%致死率%紫外線（UV）0（對照）215100%0%111453.02%46.98%3136.05%93.95%2）觀察誘變效應(yīng)，并填入下表；誘變效應(yīng)記錄表結(jié)果處理透明圈和菌落直徑大?。ǎ┘捌銱C比值對照組10-4對照組10-4對照組10-41min10-43min10-4透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV處

14、理858/5969/6105284211511/52.6實(shí)驗(yàn)結(jié)論（1）在含酪蛋白的平板上，產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌可形成蛋白質(zhì)水解圈。（2）由誘變效應(yīng)記錄表的數(shù)據(jù)知誘變時(shí)間為3min稀釋度為10-4的菌落的HC比值大于誘變時(shí)間為1min稀釋度為10-4的菌落的HC比值，故誘變時(shí)間為3min稀釋度為的菌株對應(yīng)的斜面培養(yǎng)物可以作為進(jìn)行誘變選育的菌株。（3）由紫外線誘變結(jié)果可知,對照組的菌落數(shù)為215，誘變時(shí)間為1min的存活菌落數(shù)為114,可算出其存活率為114/215=53.02%，同理誘變時(shí)間為3min的存活菌落數(shù)為13，其存活率為13/215=6.05%.（4）各誘變時(shí)間的不同存活率不同，且誘變時(shí)間短的存活率高，誘變時(shí)間長的存活率低。2.7問題和討論1) 用于誘變的菌懸液（或孢子懸液）為什么要充分振蕩？答：用于誘變的菌懸液之所以要充分振蕩是：（1）菌種的生長是需要營養(yǎng)物質(zhì)的，振蕩就可以讓菌液瓶中的營養(yǎng)物質(zhì)上下分布更加均勻這樣就更有利于菌種均勻的生長不至于出現(xiàn)有的地方長得太密或者有的地方出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象；（2）菌種的生長是需要氧氣的，振蕩就是為了使菌液瓶中的氧氣分布均勻，從而使菌種分布均勻而良好的生長。2) 經(jīng)紫外線處