幾種常用的固定劑

1、幾種常用的固定劑固定劑最先應(yīng)用在光學顯微技術(shù)中，但光學顯微鏡中使用的沉淀凝集蛋白性的固定劑對電鏡并不特別適用。于是人們引入四氧化鉞和中性甲醛進行固定。早期的電鏡生物樣品化學固定法都采用四氧化鉞單一固定，但四氧化鉞不能很好地保存糖原和其它碳水化合物，而且四氧化鉞在組織中的滲透速度比較慢（約2mm/h。而早期使用的中性甲醛也令人很不滿意，因為早期使用的甲醛很不純，含有甲酸和甲醇的殘留（一般有10-15%）,甲醇的存在對樣品的保存很不利，于是后來人們改進了甲醛的制備方法，使用多聚甲醛新鮮配制甲醛，提高了它的純度。1963年Sabatini、Bensch和Barrnett推薦使用醛類（特別是戊二醛）作

2、為初級固定劑。使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化鉞后固定的雙重化學固定對大多數(shù)動物和植物組織都十分有效，因而成為目前大多數(shù)實驗室常規(guī)的固定方法。電鏡中使用的固定劑都有毒性，操作時都要很小心，盡可能在通風櫥中完成操作。如果實驗室中發(fā)生固定劑泄漏，必須立即用大量奶粉覆蓋泄漏出來的溶液，待反應(yīng)充分后收集處理。四氧化鉞（Osmiumtetroxide）四氧化鉞是一種很強的氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶，分子量254,飽和水溶液的濃度為7.24%,它的水溶液為中性，有極大毒性。市售有密封的四氧化鉞晶體和四氧化鉞水溶液兩種。四氧化鉞晶體溶于水的速度很慢，必要時可以使用超聲波設(shè)備來加速溶解。市面上也有

3、已經(jīng)配制好的2%四氧化鉞水溶液出售，使用相當方便。但要特別注意的是無論是四氧化鉞晶體還是水溶液都會揮發(fā)出四氧化鉞氣體，因此應(yīng)將四氧化鉞置于密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鉞氣體對呼吸系統(tǒng)有刺激，對眼睛有嚴重的破壞作用，因此在使用時應(yīng)特別小心，盡可能在通風櫥中進行，并且嚴格控制用量。廢棄的四氧化鉞溶液應(yīng)加入酒精水溶液或硫酸亞鐵溶液，使四氧化鉞轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低毒性方便收集處理。四氧化鉞作為固定劑有如下優(yōu)點：1,四氧化鉞可以與脂類、糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對脂類的固定作用可以補充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點。其反應(yīng)方程式如下：2,能增加膜的反差，起到"電子染色”作用。用四氧化鉞固定的

4、材料，往往細胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。這是由于被還原的鉞沉積在細胞膜結(jié)構(gòu)上，而鉞是一種原子序數(shù)較高的元素，能加強它們的電子散射（質(zhì)量密度大），所以四氧化鉞作為固定劑的同時，又可作為電子染料，使被固定的樣品圖像有較好的反差。3,四氧化鉞會破壞大部分細胞膜的半透膜特性，配制四氧化鉞固定液不用考慮滲透壓。四氧化鉞雖然具有以上優(yōu)點，但它也存在不少缺點：四氧化鉞滲透力弱，所以組織塊要小。否則，將從組織塊表面到中間形成一個固定梯度，致使內(nèi)部自溶過程繼續(xù)進行引起組織塊內(nèi)部固定不好。不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且對微管固定效果也不理想。固定的時間不宜太長。時間過長，會使組織變脆，給切片帶來困難。此外四氧化鉞與蛋

5、白質(zhì)、不飽和脂肪酸交聯(lián)形成的復(fù)合體都是易溶于水的物質(zhì)，特別是在長時間的固定后，更易溶解。因此，使用四氧化鉞固定樣品，時間控制在12小時較為適宜。四氧化鉞能與乙醇或醛類起氧化-還原反應(yīng)，生成沉淀。所以，醛類處理過的樣品轉(zhuǎn)入四氧化鉞固定之前或四氧化鉞固定之后轉(zhuǎn)入乙醇溶液脫水之前都必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗干凈。四氧化鉞是酶的鈍化劑，不能用于細胞化學的研究。醛類固定劑甲醛（formaldehyde）甲醛分子中只有一個碳原子，含有一個醛基，分子式為$CH_2O$分子量為30。市面上雖然有多種形式的甲醛溶液出售，但它們含有少量的甲酸和甲醇，對被固定的樣品產(chǎn)生不良影響，適合電鏡固定使用的只有通過由多聚甲醛

6、（paraformaldehyde）新鮮制備的甲醛溶液。甲醛溶液的毒性很大，即使是稀釋液也要格外小心操作。甲醛溶液對皮膚有硬化作用，長時間接觸可能導(dǎo)致皮膚破裂、皮炎或是過敏癥狀；甲醛極易揮發(fā)，它對呼吸道也有影響，長時間暴露在甲醛氣體中會使嗅覺敏感度降低；此外甲醛對眼睛也有影響，而且還被認為是致癌物質(zhì)。因此在操作甲醛粉末或溶液時都必須很小心，帶上手套并在通風櫥中進行。少量廢棄的醛類試劑（甲醛、戊二醛和丙稀醛等）可以直接在大量流水沖稀的情況下倒進水池內(nèi)（但要注意有關(guān)部門的有關(guān)規(guī)定），當然少量的醛類試劑與過量的1M甘氨酸混合后，再在大量流水沖稀的情況下倒進水池，會更安全。通常100ml的甲醛（1%）

7、需要50ml的1M甘氨酸，100ml1%戊二醛則需要35ml,而丙稀醛需要40ml。大量的醛類試劑必須集中回收處理。甲醛作為固定劑有如下特點：由于甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛強，反應(yīng)溫和，可用于細胞組織化學研究的前固定。而且它不象戊二醛有兩個醛基，引入較少的游離醛基到組織細胞中，因而在一些細胞組織化學研究中更有利。但它的反應(yīng)是部分可逆的，對細胞基質(zhì)保存差，脫水后大部分基質(zhì)丟失，所以不少實驗室不單獨使用甲醛來固定樣品，而將它與戊二醛配制成混合固定液使用。甲醛對生物樣品的作用與戊二醛相似，主要引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。在水溶液中，單個的甲醛分子以HO-CH2-OH的形式存在。反應(yīng)如下：R-NH2+H

8、OCH2OH->R-NH-CHa-OH+H2OR-NH-CH2-OH十*一NH2>R-NH-CH2-NH-與戊二醛不同，甲醛既與DNAZ與核蛋白反應(yīng)，但這些反應(yīng)都是部分可逆的。另外，甲醛固定脂類的能力不強，可以與脂類相連的蛋白質(zhì)作用。戊二醛(glutaraldehyde)戊二醛是一種五碳醛，含有兩個醛基。分子式為$C_5H_8O_2網(wǎng)子量為100。電鏡固定通常用市售的25%的戊二醛水溶液稀釋成需要的濃度。其pH為4.0$sim$5.0。氧氣、高溫、中性或堿性pH均能使戊二醛發(fā)生聚合失去醛基，并降低交聯(lián)效力，所以平時這種原液應(yīng)保存在低溫處。此外戊二醛存放時間過長時，pH值會降低，顏色

9、變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其它雜質(zhì)時，必須純化后才能使用。戊二醛對皮膚有硬化作用，但它的揮發(fā)性較甲醛弱，最好能在通風櫥中操作。戊二醛作為固定劑有如下特點：它的反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑。但它的滲透速度較慢，必要時配合甲醛使用效果更佳。它是蛋白質(zhì)的強固定劑。它能快速而不可逆地與氨基反應(yīng)，和甲醛相似，戊二醛的一個醛基與氨基反應(yīng)，脫水后生成不穩(wěn)定的Schiff鍵化合物。其反應(yīng)的可能途徑如下：一。-CHO+NH2-R->-CH2CH=N-R+凡。由于戊二醛有兩個醛基，它可以通過與相鄰的另一氨基反應(yīng)，而產(chǎn)生交聯(lián)作用。戊二醛的兩個醛基也可能與同一氨基作用，形成環(huán)狀

10、結(jié)構(gòu)，如下R這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以進一步與另一戊二醛反應(yīng)，生成丁間醇醛冷凝物（AldolCHCIL-CHrCIL-CH()同坪醉冷凝物condensate）0這種化合物與氧分子共同作用，生成穩(wěn)定的口密噬類衍生物（Pyridinederivatives）,并在此過程中發(fā)生交聯(lián)。jtVffIQEBJFMtaiMMin喀險央行寸物m與甲醛不同，戊二醛的這一步反應(yīng)是不可逆的，而且需要氧氣的參與。由于大塊的樣品內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足，戊二醛在大塊樣品的內(nèi)部無法形成穩(wěn)定的生成物，會導(dǎo)致樣品內(nèi)部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時，小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過交聯(lián)作用固定蛋白質(zhì)的過程會伴隨氫離子的釋放，使樣

11、品pH值降低。為了維持pH值穩(wěn)定在最佳水平，在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩沖液。戊二醛能通過固定核蛋白來固定組織和細胞中的DNAF口RNA能保存糖原，也可以固定和蛋白質(zhì)有關(guān)聯(lián)的或含有氨基和亞氨基的脂類。但是只使用戊二醛固定的樣品無法阻止后面的脫水、滲透和包埋過程對樣品脂類的抽提，因而對細胞膜的固定效果不理想。戊二醛在固定過程中并不完全破壞細胞膜的半透膜特性，因而需要選擇合適的固定液滲透壓，以免造成固定假象。但合適的固定液滲透壓隨被固定細胞和緩沖液的種類改變，很難找到一個通用的滲透壓。在實際操作中，$1.0%-2.5%$戊二醛（使用0.1M磷酸鹽緩沖液或0.1M二甲腫酸鹽緩沖液）在一般情況下，

12、已經(jīng)能提供理想的固定效果。除非觀察到明顯的滲透壓造成的假象，一般不對固定液專門進行滲透壓調(diào)節(jié)。用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進行長時間固定（但最好不要超過一個星期），因而適用于遠離實驗室或野外現(xiàn)場取材。但戊二醛在稀釋溶液中會自行發(fā)生一系列反應(yīng)，因而固定液應(yīng)盡可能新鮮配制中。其它固定劑醋酸鈾（uranylacetate）既是一種固定劑又是一種染色劑。它可以與磷酸基團反應(yīng)，從而固定DNAfDRNA以及含有磷酸基團的磷脂，從而對膜結(jié)構(gòu)的保存有幫助。另外，它可以與蛋白中的酸性基團（如大冬氨酸殘基、谷氨酸殘基）和堿性基團（如賴氨酸殘基）反應(yīng)，從而起固定蛋白的作用。但醋酸鈾不能很好得保存糖原。通常在使

13、用了醛類固定劑和四氧化鉞固定劑后，再使用$0.5-1.0%$的醋酸鈾水溶液，進行第三重固定。操作醋酸鈾時要特別注意，盡管市售的醋酸鈾放射性不強，但它仍是一種潛在的致癌物。醋酸鈾應(yīng)密封于棕色瓶陰涼處保存。丙烯醛(acrolein)是一種三碳醛，含有一個醛基和一個雙鍵。它比甲醛和戊二醛活潑，滲透組織的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和磷脂，最好作為甲醛或戊二醛固定液的添加劑使用。通常使用市售密封的100%5烯醛液體，固定時使用的濃度小于1%它溶于水的速度慢，毒性很大，著火點低，儲存和使用它都比上述另外兩種醛類危險，非必要時不推薦使用。丙烯醛非?；顫娗覔]發(fā)性很強，即使是操作稀釋后的溶液也

14、要格外小心，所有與丙烯醛相關(guān)的操作絕不能離開通風櫥進行，并且最好有經(jīng)驗豐富的操作者在場指導(dǎo)。丙烯醛適合于固定大塊的樣品，植物組織或有厚細胞壁的微生物樣品，以及表面覆蓋有幾丁質(zhì)或蠟質(zhì)的樣品。但丙烯醛不適用于整個動物的灌注固定。丹寧酸(Tannicacid)是一種從植物中提取的物質(zhì)，泛指五倍子酸(gallicacid)糖甘或多聚糖甘。大分子很難滲透到組織中，因此電鏡中使用低分子量的丹寧酸。丹寧酸既是一種強的固定劑，能固定許多蛋白以及糖類衍生物，又是一種媒染劑，能增強對重金屬(如鈾、鉛)的吸收，從而增強樣品反差，特別是細胞外膜、彈性纖維、細胞連接、肌肉纖維等。由于丹寧酸滲透速度慢，通常只用作滲透速度

15、快的固定劑的添加劑使用。丹寧酸沒有固定的用法，0.5-2.0%丹寧酸和0.5mg/ml皂角音(saponin,增加丹寧酸的滲透速度)與2.5-4.0%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定時間要延長到3-4小時以上，并且推薦使用醋酸鈾作第三重固定。丹寧酸適用于灌注固定。重銘酸鉀(potassiumdichromate)在固定中有兩種作用，一是緩沖作用，二是固定作用，幫助保存脂類和糖類。在處理神經(jīng)組織樣品時，因為重銘酸鉀能很好地保存髓磷脂，可與四氧化鉞配合使用，作為第二重固定劑。但需要注意的是，重銘酸鉀是一種致癌物質(zhì)，應(yīng)小心操作。高鈕酸鉀(potassiumpermanganate)可以與脂類

16、反應(yīng)，增強膜結(jié)構(gòu)的反差?？梢员４鍰NAft糖原，但有一定的抽提作用，幾乎無法固定細胞內(nèi)的顆粒性或纖維狀結(jié)構(gòu)，可能會引入一些假象。穿透性強，適用于有厚細胞壁或蠟質(zhì)層包被的植物及昆蟲樣品。使用時可以不加緩沖液，固定時間不宜太長，,0.5-1.0%高銳酸鉀溶液固定30分鐘到2小時。附錄二固定與染色一、固定細胞學實驗的第一步應(yīng)對觀察之機體的組織先行固定，然后再作進一步的處理和研究（應(yīng)用冰凍切片法事先可不經(jīng)固定）。（一）固定的目的1、盡量保持組織、細胞、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其成分的原來狀態(tài)，并能較長時間的保存?zhèn)溆谩?、固定后材料硬化，便于切削。3、固定是使細胞內(nèi)含物發(fā)生必要的物理及化學變化，有利于進一步的染色處理

17、，獲得良好的制片效果。據(jù)此，固定劑應(yīng)具備下述三點基本要求：能夠迅速滲入組織內(nèi)殺死細胞，并兼有保存作用。對于細胞內(nèi)含物，特別是要研究部分要盡可能少產(chǎn)生變化，對于細胞和組織不發(fā)生或盡可能少發(fā)生膨脹和收縮作用，使其保持與生活時期相似的面貌。能夠獲得良好的染色效果。（二）固定液常用的固定劑有酒精、冰醋酸、福爾馬林（甲醛）、苦味酸、氯仿、銘酸、升汞、重銘酸等。這幾種藥劑能作為固定劑單獨使用，但事實上每種藥都不能同時具備上面所提到的要求，故應(yīng)用時都采用混合固定液。下面是幾種常用的混合固定液：1、卡爾諾氏固定液（Caroy'sfixative）（1）100%酒精3份冰醋酸100%酒精6份冰醋酸氯仿有

18、兩種不同的配方，可根據(jù)不同材料分別應(yīng)用1份1份3份這兩種固定液滲透，殺死迅速，固定作用很快，植物根尖固定只需15分鐘，花粉囊約1小時，若固定時間太長（超過48小時）則會破壞細胞，其中的純酒精固定細胞質(zhì)，冰醋酸固定染色質(zhì)，并可防止由于酒精而引起的高度收縮和硬化。液適于植物；液適于動物。材料從固定液中取出后用95%酒精洗滌，直至去盡醋酸味（換液兩次即可）然后保存于70%酒精內(nèi)。2、萬能固定液它主要是由甲醛醋酸一一酒精混合配成。這類混合劑通常稱為“FAA、“標準固定液”、或“萬能固定液”，是制片中良好的固定劑兼保存劑，但不能作染色體研究用，其混合比例變更很廣泛，現(xiàn)僅列舉兩種。液常用一般植物組織和器官

19、的固定。液則用于植物胚胎材料的固定。（1）50%（或70%）酒精90毫升冰醋酸5毫升甲醛5毫升50%酒精89毫升冰醋酸6毫升甲醛5毫升3、銘酸醋酸固定液（Chromoacetic）根據(jù)各溶液質(zhì)量的差別，可分為弱、中、強三種銘酸12-24小時或更長醋酸混合液。此三種固定液對不同的材料有不同的作用，一般此種固定液固定處理要時間，流水沖洗需24小時，要徹底去掉銘酸，以免影響以后的染色處理。(1)銘醋酸弱液10%銘酸水溶液2.5毫升10%醋酸水溶液5.0毫升蒸儲水加至100毫升此液適合于固定藻類、菌類、苔葬等。銘醋酸中液10%銘酸水溶液7毫升10%醋酸水溶液10毫升蒸儲水加至100毫升此液適于固定植物

20、根尖、小子房或分離出來的胚株。銘酸酸強液10%銘酸水溶液10毫升10%醋酸水溶液30亳升蒸儲水加至100毫升此液適于固定木材、堅硬的葉片及成熟的子房等。4、布安氏固定液(Bouin'sfixafive)苦味酸(飽和)15份甲醛5份冰醋酸1份配制方法：此液需用前臨時配制，隨配隨用，否則失效無用?？辔端釣辄S色結(jié)晶體。溶解度很低，故其飽和液可預(yù)先一次配好多量保存?zhèn)溆?約500ml蒸儲水中加入苦味酸結(jié)晶1015克，振蕩使其溶解)，固定液在一切準備工作就緒后，立即要固定材料時，再按上面比例將三種藥液混合。此液適合于固定動物組織及植物的胚囊和根尖，固定時間24小時，取出放于清水中洗滌，除去表面的苦

21、味酸，然后以3570%酒精洗滌，最好在其中加入少許碳酸鋰(Li2CO3)以除去材料內(nèi)部的黃色。二、染色染色是使我們研究的組織或細胞結(jié)構(gòu)明顯、清晰、可見，以便觀察和研究，生物學上用的染料，按其來源可分為兩大類，即：天然染料與人工染料。前者數(shù)量少，為天然產(chǎn)物，取自動物和植物，如洋紅、蘇木精、地衣紅等；而后者的種類多，為人工合成；多數(shù)由煤焦油中提取，故又稱煤焦油染料，如：結(jié)晶紫、吉姆薩、堿性品紅、酸性品紅、甲基綠、焦寧等。下面介紹幾種在細胞學制片中常用的染色劑。1、醋酸洋紅(Acetic-carmine)冰醋酸45毫升蒸儲水55毫升洋紅飽和配制方法：先將冰醋酸及蒸儲水混合煮沸，逐漸加入洋紅至飽和為止

22、，冷卻過濾即成。此染色劑對于植物花粉母細胞，根尖細胞核的染色體，果蠅唾腺和神經(jīng)球細胞等染色體染色效果良好，故被廣泛的應(yīng)用于涂抹制片法研究植物細胞的核與染色體。2、鐵磯醋酸洋紅(Iron-acetic-carmine)洋紅1克45%醋酸100毫升4%鐵磯液數(shù)滴配制方法：將1克洋紅溶解在煮沸的45%的醋酸液中，冷卻后過濾，再加數(shù)滴4%鐵磯液，顏色變?yōu)槠咸丫粕闯?。此液對臨時涂抹制片的染色，效果十分理想。3、丙酸鐵洋紅水合三氯乙醛(PICCH)在100毫升煮沸的45%丙酸中加入0.5克洋紅，并繼續(xù)迥流6小時，冷卻后過濾，然后在5毫升上述染液中加入2克水合二氯乙醛，充分溶解，搖勻，再加入數(shù)滴Fe(OH

23、)3的丙酸飽和液(以不發(fā)生沉淀為準)。這一配方對某些用一般染料效果差的材料，著色性強，而且加入水合三氯乙醛，使細胞較為透明。4、醋酸地衣紅(Acetic-orcein)冰醋酸45毫升蒸儲水55毫升地衣紅配制方法：同醋酸洋紅，使用時根據(jù)具體要求稀釋再用5、醋酸龍膽紫(Acetic-centianviolet)1045%醋酸100毫升龍膽紫0.75克配制方法：加熱使其溶解，待冷卻后過濾備用，其中龍膽紫亦可用結(jié)晶紫(Crystalviolct)代替醋酸之濃度不同材料而異，使用者應(yīng)按具體材料進行摸索，找出最適濃度6、希夫氏(Schiff's)試劑堿性品戲(Fuchsinbasic)0.5克1m

24、ol-1-1-HCl鹽酸10毫升偏重亞硫酸鈉(鉀)0.5克活性炭若干蒸儲水100毫升配制方法：把0.5克堿性品紅溶于100毫升煮沸蒸儲水中，繼續(xù)煮沸隨時攪拌5分鐘，冷卻至50C過濾(棕色瓶中)，濾液中加入1mol-1-1鹽酸10毫升，冷卻至25c再加0.5克偏重亞硫酸鈉(鉀)，塞緊瓶塞振蕩數(shù)分鐘，置黑暗外24小時，溶液應(yīng)呈無色或茶色，即可使用，倘使染液有色，則可加入若干活性炭，過濾即得，如不符合要求，可再重復(fù)一次。7、蘇木精(Hematoxylin)蘇木精0.5克或4克95%酒精10毫升蒸儲水90毫升配制方法：先將蘇木精于95%酒精中溶解，再加入蒸儲水，置于棕色瓶中，瓶口蒙數(shù)層紗布擰緊,經(jīng)一個

25、月以上氧化才可應(yīng)用，同時需過濾。若加入0.1克碘酸鈉可立即成熟供用。8、德拉菲氏(Dclafied's)蘇木精甲液蘇木精1克純酒精6毫升硫酸鋁鏤飽和水溶液(1:11)100毫升乙液25毫升純甘油甲醇25毫升配制方法：將蘇木精溶于純酒精中，然后一滴一滴地加入硫酸鋁鏤飽和溶液并隨時攪動；暴露于陽光或空氣中；(3)1周到10天后加入乙液，再經(jīng)12個月后，顏色變深，過濾后即可用，如急需，可加入少許過氧化氫，使之提早成熟應(yīng)用。此液配成后可長期保存使用。9、丙酸鐵磯-蘇木精貯存液：A、2克或8克蘇木精(根尖染色)溶于100毫升50%的丙酸或乙酸；B、0.5克鐵磯溶于100毫升50%的丙酸或乙酸。染

26、色液：A液或B液等量混合，并在每5毫升上述混合液中加入2克水合三氯乙醛，充分溶解，搖勻。貯存液能較長時間保存，染色液一般只能保存一個月，而在2周內(nèi)使用效果最佳，較適合于花藥的壓片。10、甲基綠焦寧(Methyi-Green-Pyroin)配方甲液石碳酸0.25克蒸儲水100毫升甲基綠1克乙液石碳酸0.25克蒸儲水100毫升焦寧1克使用前將1份甲液和1份乙液混和即成。此液能對DNAaRNA區(qū)分染色。配方甲基綠0.5克焦寧0.25克甘油20毫升0.5%石碳酸100毫升配制方法：先將甲基綠、焦寧溶于2.5毫升95%酒精中，然后加20毫升甘油和100毫升0.5%石碳酸混合即成。11、石碳酸品紅(Carbolfuchsin)甲液堿性品紅3克70%酒精100毫升乙液甲液10克5%石碳酸水溶液90毫升丙液乙液55克6毫升6毫升冰醋酸甲醛（37%）染色液丙液10毫升4