怎樣選擇色譜柱液相色譜柱的種類與方法開發(fā)ppt課件

1、液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)奧妙科技奧妙科技/AUMI Technologies US內(nèi)容概要內(nèi)容概要色譜根本概念回想色譜根本概念回想色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜根本概念回想色譜根本概念回想色譜chromatography色譜原理色譜分類：氣相/液相和高效液相HPLC；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相色譜功能：分析種類/定量，純化液相色譜儀器構(gòu)造及功能：泵，脫氣機(jī)，混合器，進(jìn)樣器閥，色譜柱，柱溫箱，檢測(cè)器流通池分別度)1()1()4(kkaaNRs Rs - Resolution N Theoretical Plate Number Selectivity

2、 k Retention Factor拖尾拖尾1.Separation of Compounds A and B靈敏度：Limit of Detection：Limit of Quantification 柱效峰形拖尾因子重現(xiàn)性分別度分別度 保管時(shí)間，保管時(shí)間，選擇性選擇性 柱效柱效靈敏度靈敏度色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜柱與色譜條件對(duì)色譜性能的影響色譜柱與色譜條件對(duì)色譜性能的影響分別度分別度 - 選擇性選擇性 鍵合類型，基質(zhì)外表特性；流動(dòng)相、溫度鍵合類型，基質(zhì)外表特性；流動(dòng)相、溫度 - 柱效柱效 保管體積，粒徑，柱長(zhǎng)，基質(zhì)外表特性；流動(dòng)相保管體積，粒徑，柱長(zhǎng)，基質(zhì)

3、外表特性；流動(dòng)相， 溫度，上樣量，流速溫度，上樣量，流速峰對(duì)稱性峰對(duì)稱性 基質(zhì)外表特性，鍵合類型，流動(dòng)相，溫度基質(zhì)外表特性，鍵合類型，流動(dòng)相，溫度保管體積保管體積 柱長(zhǎng)，孔隙率，比外表積，基質(zhì)外表特性，鍵合柱長(zhǎng)，孔隙率，比外表積，基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度類型；流動(dòng)相，溫度靈敏度靈敏度 粒徑，基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度粒徑，基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度流動(dòng)相流動(dòng)相 10 mm) 用于純化制備用于純化制備柱填料對(duì)色譜柱性能的影響柱填料對(duì)色譜柱性能的影響柱填料對(duì)柱填料對(duì)

4、C18色譜柱性能的影響：粒徑色譜柱性能的影響：粒徑 硅膠粒徑和類型對(duì)柱效的影響硅膠粒徑和類型對(duì)柱效的影響d硅膠粒徑和類型對(duì)壓力的影響硅膠粒徑和類型對(duì)壓力的影響柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：粒徑色譜柱性能的影響：粒徑II 目前市場(chǎng)主要可供選擇的填料粒徑目前市場(chǎng)主要可供選擇的填料粒徑 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色譜柱：匹配快快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀速色譜儀 2.7m 多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)快速分多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)快速分別別(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析普通快速分析 5.0m 常規(guī)分析常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高顆粒越小，柱效越高,

5、但是耐污染性能下降，柱壓升高但是耐污染性能下降，柱壓升高. 柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：比外表積色譜柱性能的影響：比外表積 l 每克填料的外表積，與粒度，孔徑有關(guān)每克填料的外表積，與粒度，孔徑有關(guān)l 比外表積大，保管添加，載樣量添加，平衡時(shí)比外表積大，保管添加，載樣量添加，平衡時(shí)間添加間添加(梯度洗脫尤為留意梯度洗脫尤為留意)l 根據(jù)需求選擇適宜的比外表積根據(jù)需求選擇適宜的比外表積柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑色譜柱性能的影響：孔徑I l 多孔資料的多孔資料的95%以上外表以上外表在孔內(nèi)部在孔內(nèi)部l 樣品分子直徑小于平均孔樣品分子直徑小于平均孔徑，才干進(jìn)入微粒內(nèi)部徑，

6、才干進(jìn)入微粒內(nèi)部l 孔徑至少是樣品流體學(xué)直孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的徑的4倍倍l 300孔徑用于：超越孔徑用于：超越50個(gè)氨基酸的肽或個(gè)氨基酸的肽或25個(gè)殘基的個(gè)殘基的低聚寡核苷酸低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，樣品分子直徑小于平均孔徑，才干進(jìn)入微粒內(nèi)部才干進(jìn)入微粒內(nèi)部柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑色譜柱性能的影響：孔徑II 由于小孔徑填料比外表積大，小分子的保管值在小孔徑填料通常更大由于小孔徑填料比外表積大，小分子的保管值在小孔徑填料通常更大條件： C8色譜柱，4.6150mm，3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈水中；20min梯

7、度，1030%B；60C，1.5ml/min柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度色譜柱性能的影響：硅膠純度I2.3-二羥基萘OHOHOHOH2.7-二羥基萘 min01234567mAU 010203040 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091702.D) 3.008 4.084min0123456mAU 01020304050 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07090605.D) Area: 253.288 2.275 Area: 400.399 2.889min01234567mAU 051015202530354

8、0 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091208.D) 2.450 3.471min0246810mAU 510152025 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091202.D) 3.944 Area: 176.686 5.934TF=1.31Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm min0123456789m

9、AU 010203040 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091711.D) 2.899Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流動(dòng)相：流動(dòng)相： 甲醇：水甲醇：水=65：35流速：流速： 1 mL/min溫度：溫度： 35檢測(cè)波長(zhǎng)：檢測(cè)波長(zhǎng)： 230 nm 進(jìn)樣量：進(jìn)樣量： 20 L硅膠純度金屬含量硅膠純度金屬含量硅膠基質(zhì)類型及開展史硅膠基質(zhì)類型及開展史Type A：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易構(gòu)成拖尾和死吸附Type B：原料來源：有機(jī)硅烷四乙氧基硅烷水解/燒

10、結(jié)/酸洗雜化及外表雜化整體柱殼層柱柱填料對(duì)柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度色譜柱性能的影響：硅膠純度II 硅膠純度金屬含量硅膠純度金屬含量d固定相對(duì)色譜柱性能的影響：硅羥基的影響固定相對(duì)色譜柱性能的影響：硅羥基的影響剩余硅羥基的影響剩余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動(dòng)相的普通硅膠當(dāng)流動(dòng)相的 pH 值大于值大于 4.5-5.0 時(shí)，外表時(shí)，外表的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。處理方法處理方法封尾封尾雙層外表修飾雙層外表修飾外表雜化外表雜化固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響封尾封尾鍵合填料與小硅烷進(jìn)展后續(xù)反

11、鍵合填料與小硅烷進(jìn)展后續(xù)反響，如三甲基氯硅烷，反響掉響，如三甲基氯硅烷，反響掉部分剩余硅羥基，以添加外表部分剩余硅羥基，以添加外表覆蓋率。覆蓋率。缺陷：缺陷：不能完全反響仍有不能完全反響仍有50%的硅的硅羥基未被反響羥基未被反響在在pHC3C1，長(zhǎng)鏈之間差別不大，長(zhǎng)鏈之間差別不大 反相鍵合相的保管行為反相鍵合相的保管行為不同廠家色譜柱的不同廠家色譜柱的保管值，選擇性與峰型保管值，選擇性與峰型色譜柱：色譜柱：4.6*150mm，流動(dòng)相：乙腈流動(dòng)相：乙腈0.05M磷酸鉀緩沖液，磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：流速：1ml/min，拖尾峰 T0尿嘧啶P: 吡啶吡啶L: 苯酚苯酚N: N

12、,N-二甲基苯胺二甲基苯胺B: 4-丁基苯甲酸丁基苯甲酸J: 甲苯甲苯固定相對(duì)色譜柱性能的影響：固定相對(duì)色譜柱性能的影響： 基質(zhì)外表特性基質(zhì)外表特性+鍵合類型鍵合類型 鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性 低低pH值，鍵合相流失值，鍵合相流失 高高pH值，硅膠溶解值，硅膠溶解影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn)影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn) 鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響低低pH值，鍵合相流失值，鍵合相流失鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響II空間位阻維護(hù)，延緩鍵合相流失空間位阻維護(hù)，延緩鍵合相流失固定相對(duì)色譜柱性能的影響：固定相對(duì)色譜柱性能的影響

13、： 鍵合硅膠的穩(wěn)定性鍵合硅膠的穩(wěn)定性高高pH值，硅膠基質(zhì)溶解值，硅膠基質(zhì)溶解pH9時(shí)，色譜柱的穩(wěn)定性時(shí)，色譜柱的穩(wěn)定性固定相對(duì)色譜柱性能的影響：固定相對(duì)色譜柱性能的影響： 鍵合硅膠的穩(wěn)定性鍵合硅膠的穩(wěn)定性碳雜化，延硅膠緩高碳雜化，延硅膠緩高pH值水解值水解雜化顆粒：雜化顆粒：Waters Xterra外表碳雜化表示圖外表碳雜化表示圖pH=12 條件下的穩(wěn)定性min051015202530mAU0510152025303540 2.080 2.320 4.068 6.961 9.775 14.276min051015202530mAU0510152025303540 2.040 2.311 4.

14、337 7.090 9.965 14.2714 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um 1h200 h總結(jié)：如何選擇色譜柱和相應(yīng)的色譜條件總結(jié)：如何選擇色譜柱和相應(yīng)的色譜條件了解目的化合物的性質(zhì)：構(gòu)造官能團(tuán)、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性了解色譜柱的性質(zhì)粒徑，孔徑，比外表積 保管強(qiáng)度和柱效；抗污染性基質(zhì)外表特性，鍵合類型保管強(qiáng)度，選擇性，柱效，對(duì)稱性，靈敏度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性選擇相應(yīng)的色譜條件色譜柱選擇替代：粒徑，比外表，基質(zhì)外表特性，鍵合類型類似新方法開發(fā)：粒徑：2um vs 3um vs 5u

15、m 分析時(shí)間，靈敏度，儀器，價(jià)錢，壽命內(nèi)徑柱長(zhǎng)：內(nèi)徑3mm vs 4.6 vs 7.8對(duì)分別影響不大，本錢；柱長(zhǎng)與粒徑相關(guān)比外表：低比外表耐污染，高比外表利于分別孔徑：在滿足比外表前提下大孔徑較好硅膠基質(zhì)外表特性：盡能夠運(yùn)用高純硅膠；盡能夠運(yùn)用低酸性硅膠；當(dāng)流動(dòng)相盡能夠運(yùn)用外表雜化；運(yùn)用多硅羥基殘留，可加強(qiáng)對(duì)于極性化合物保管或減弱對(duì)于非極性化合物保管鍵合類型：取決于選擇性和流動(dòng)相要求；具有一定極性的可以作為首選嘗試；耐酸：選擇；耐堿：Durashell 封尾與不封尾：封尾減弱硅羥基影響；不封尾：提高硅羥基影響，加強(qiáng)極性物質(zhì)保管，降低柱流失。min02.557.51012.51517.52022.5mAU -200204060 VWD1 A, Wavelength=254 nm (ZJZ09050416.D) 5.229 5.566 7.820 8.798 9.588min02.557.51012.51517.52022.5mAU -200204060 VWD1 A, Wav