生化試劑的基礎(chǔ)知識

1、生化試劑的基本知識一、生化試劑的分類2(一)按照化學(xué)性質(zhì)分類2(二)按照臨床應(yīng)用分類2二、反應(yīng)速度特性2(一)終點法試劑2(二)動力學(xué)法試劑3三、顯色原理4(一)NAD-NADH和NADP-NADPH系統(tǒng)5(二)p-NP和p-NA系統(tǒng)5(三)H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng)5(四)抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)5(五)其它顯色反應(yīng)6四、性能評價方法6(一)主要性能指標：6(二)性能評價方法6一、 生化試劑的分類(一) 按照化學(xué)性質(zhì)分類1. 酶類：包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,-HBDH,LDH,CK,CK-MB,-AMY,MSO,ADA,ChE等。2. 底物/代謝產(chǎn)物類：包括TG,TC,HDL-C

2、,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,CO2等。3. 無機離子類：包括Ca,P,Mg,Cl等。4. 特種蛋白類：包括apoAl,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子)，IgG,IgA,IgM等。(二) 按照臨床應(yīng)用分類1. 無機離子：包括Ca，P，Mg，Cl等。2. 肝功能：包括ALT，AST，r-GT，ALP，MSO，T-Bil，D-Bil，TBA，TP，Alb等。3. 腎功能：UA，UREA，Cr等。4. 心肌酶譜：CK，CK-MB，LDH，-HBDH，AST，MSO。5. 糖尿?。篏LU等。6. 前列腺疾?。篈CP，p-ACP

3、等。7. 胰腺炎：-AMY。8. 血脂：TC，TG，HDL-C，LDL-C，apoA1，apoB，Lp(a)。9. 痛風(fēng)：UA。10. 有機磷中毒：ChE。11. 免疫性疾病：C3，C4，PFB(B因子)， IgG，IgA，IgM，Kappa鏈，Lambda鏈。二、 反應(yīng)速度特性按照反應(yīng)速度，可以分為終點法試劑和動力學(xué)試劑。而動力學(xué)試劑又可再分為零級動力學(xué)法和一級動力學(xué)法。(一) 終點法試劑終點法，指經(jīng)過一段時間(一般為幾分鐘)的反應(yīng)，反應(yīng)進行到完全，使全部底物(被測物)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，稱終點法，更確切地說應(yīng)稱平衡法，這是最理想的分析類型。如圖（1）。整個反應(yīng)達到平衡，由于正向反應(yīng)的平衡常數(shù)很大，

4、可認為所有的被測定物已轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，反應(yīng)液的吸光度不再增加(或降低)，吸光度的增加(或降低)程度與被測定物的濃度成正比。終點法對反應(yīng)條件(如酶量、pH、溫度)小的改變不敏感，只要這種改變不影響在一定時間內(nèi)反應(yīng)達到平衡即可，是最理想的反應(yīng)模型。 圖（1）屬于終點法的試劑主要有：TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，Cr（氧化酶法），NH4+，CO2 ， Ca，P，Mg，Cl ， apoA1，apoB，Lp(a)，C3，C4，PFB(B因子)，IgG，IgA，IgM等。(二) 動力學(xué)法試劑1. 零級動力學(xué)法零級動力學(xué)法，指反應(yīng)過程中反應(yīng)速度維持不變，

5、達到最大，與底物濃度無關(guān)，因此，在整個反應(yīng)過程中，反應(yīng)物可以勻速地生成某個產(chǎn)物，導(dǎo)致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加，減小或增加的速度（A/min）與被測物的活性或濃度成正比，主要用于酶活性的測定。如圖（2）。實際上，由于底物濃度不可能足夠大，隨著反應(yīng)的進行，底物消耗到一定程度后，反應(yīng)速度不再維持不變，同樣從啟動反應(yīng)到達到最大速度需要一定時間。因此，零級動力學(xué)法是針對特定時間而言的，各試劑商對這段時間有嚴格規(guī)定。圖（2）屬于零級動力學(xué)法的試劑主要有：ALT，AST，ALP，ACP，r-GT，-HBDH，LDH，CK，CK-MB,-AMY，MSO，ADA，ChE ，TBA等。2. 一

6、級動力學(xué)法在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，反應(yīng)速度與底物濃度的一次方成正比，由于底物在不斷的消耗，因此整個反應(yīng)的速度在不斷的減少，表現(xiàn)為吸光度的增加（或降低）速度越來越小，這類反應(yīng)達到平衡的時間很長，理論上可以在任意時間段進行監(jiān)測，但由于血清成份復(fù)雜，反應(yīng)剛啟動時反應(yīng)較復(fù)雜，雜反應(yīng)較多，經(jīng)過一段延遲時間才能進入穩(wěn)定反應(yīng)期，必需在特定時間段內(nèi)進行監(jiān)測，各試劑商對這段時間有嚴格規(guī)定。如圖（3）。在一固定時間間隔中，底物濃度的變化量正比于底物的初濃度，這是一級反應(yīng)的同性。該段時間內(nèi)吸光度的增加或降低與被測物的濃度成正比。圖（3）屬于一級動力學(xué)法的試劑主要有：Cr（苦味酸法），UREA（紫外監(jiān)測法）三、 顯色原理

7、顯色系統(tǒng)主要有以下幾種：Ø NAD-NADH和NADP-NADPH系統(tǒng)Ø p-NP和p-NA系統(tǒng)Ø H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng)Ø 抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)Ø 其它顯色反應(yīng)(一) NAD-NADH和NADP-NADPH系統(tǒng)NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰，而NAD和NADP在340nm無特征性吸收峰，利用其偶聯(lián)的脫氫酶(工具酶)反應(yīng)，根據(jù)340nm吸光度的變化，可以測定物質(zhì)的濃度或活性。作為該指示系統(tǒng)常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH和G6PDH目前利用此指示系統(tǒng)進行測定的臨床項目有：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH

8、 、 Glu、UREA、NH4+ 、CO2等。(二) p-NP和p-NA系統(tǒng)p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根據(jù)405nm吸光度的變化，可以測定物質(zhì)的濃度或活性。目前利用此指示系統(tǒng)進行測定的臨床項目有ALP、ACP、r-GT、AMY等。(三) H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng)H2O2在過氧化物酶的作用下，可使單一個或成對的無色的色素原氧化成有色的色素，導(dǎo)致某一波長吸光度的增加，因此可用來測定物質(zhì)的濃度或活性用于此指示系統(tǒng)的單一色素原有TMB、ABTS等；成對色素原有酚和4AA、MBTH和DMA等。目前利用此指示系統(tǒng)進行測定的臨床項目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu、Cr、UA等

9、。(四) 抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)特異性抗體與抗原(待測物質(zhì))在相應(yīng)的緩沖環(huán)境下反應(yīng)生成抗原抗體復(fù)合物，形成一定的濁度，導(dǎo)致特定波長透光率的改變。在抗體過剩的前提下，改變程度與抗原濃度成正比。目前利用此指示系統(tǒng)進行測定的臨床項目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。(五) 其它顯色反應(yīng)蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，在一定濃度范圍內(nèi)顏色反應(yīng)強度與蛋白質(zhì)的濃度成正比。用于TP的測定。溴甲酚綠(BCG)在非離子去污劑Brij35的存在下，可與白蛋白形成緊密結(jié)合的綠色復(fù)合物。用于Alb的測定。重氮苯磺酸鹽與膽紅素生成紅紫色偶氮膽紅素。

10、用于總膽紅素和直接膽紅素的測定。甲基麝香草酚蘭(MTB)在堿性條件下可與Ca、Mg形成有色絡(luò)合物。用于Ca、Mg的測定。四、 性能評價方法(一) 主要性能指標：1. 穩(wěn)定性：指在規(guī)定條件下經(jīng)過一段時間的保存，仍能達到相應(yīng)的性能指標，如試劑空白吸光度、線性范圍、靈敏度等。 2. 反應(yīng)靈敏度：指單位濃度(或活性)的測定物反應(yīng)所產(chǎn)生的反應(yīng)度，反應(yīng)度越高，靈敏度越大。 3. 精密度：結(jié)果間相互符合的一致程度4. 準確度：與參考測定程序結(jié)果的一致性5. 線性范圍：在規(guī)定的重復(fù)性和線性偏差下，測得的濃度或活性值與設(shè)定的濃度或活性值之間的比例關(guān)系的范圍。 6. 基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性。例如，溶液的離子強度會對分析物活度系數(shù)有影響，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect）。7. 抗干擾性：8. 其它：試劑/樣本比例、反應(yīng)時間、價格等。(二) 性能評價方法1. 穩(wěn)