生物餌料培養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)講義1

1、生物餌料培養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)講義王珺 馮永勤 海南大學(xué)海洋學(xué)院2010年6月目錄實(shí)驗(yàn)一 單細(xì)胞藻濃度的測(cè)定 1實(shí)驗(yàn)二 單細(xì)胞藻培養(yǎng)的容器、工具及用水的消毒 3 實(shí)驗(yàn)三 單細(xì)胞藻培養(yǎng)液-母液的配制 5實(shí)驗(yàn)四 單細(xì)胞藻一級(jí)培養(yǎng) 7實(shí)驗(yàn)五 輪蟲的分離與培養(yǎng) 9實(shí)驗(yàn)一 單細(xì)胞藻類濃度的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)單細(xì)胞藻類的方法。 2. 掌握使用分光光度計(jì)進(jìn)行單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)的原理、方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】 1. 制作工作曲線。取一定量的單胞藻液，稀釋成5個(gè)梯度，分別用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度（O.D.），并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定相應(yīng)藻液的藻細(xì)胞個(gè)體濃度，由于藻細(xì)胞濃度與吸光值的大小成正比關(guān)系，根據(jù)各組數(shù)據(jù)繪出吸

2、光度-藻細(xì)胞濃度的相關(guān)曲線，即工作曲線。1.1 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理 血球計(jì)數(shù)板是一塊比普通載玻片厚的載玻片特制而成的，板的中部有一“H”形的凹溝，在凹溝包圍的上、下兩塊地方比凹溝外的兩條高起的邊低0.1mm，在此部的中央劃線為一具有準(zhǔn)確面積的大小方格，在其中分為九個(gè)方格，每一大方格的面積是1mm2，在四角的大格又分為16個(gè)中格，在中央的大格分為25個(gè)中格，每一中格分為16個(gè)小格，共400個(gè)小格；另外一種計(jì)數(shù)板的中央大格分為16個(gè)中格，每一中格分為25個(gè)小格，總數(shù)400個(gè)小格，加蓋玻片后，每一大格即形成一個(gè)體積為0.1mm3的空間。2測(cè)定被測(cè)藻液的吸光度。3根據(jù)工作曲線查出藻液相應(yīng)吸光度的藻細(xì)

3、胞濃度。【實(shí)驗(yàn)用品】 一、實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計(jì)、顯微鏡、電子天平、干燥箱、血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器。 二、試劑 魯哥氏液。三、實(shí)驗(yàn)材料 25或50ml比色管（每組6支）、吸管、擦鏡紙、單胞藻液500ml、待測(cè)藻液500ml、10ml移液管（每組6支）、50ml試劑瓶、消毒海水500ml、蒸餾水。【實(shí)驗(yàn)步驟】一、分光光度計(jì)計(jì)數(shù)法 1. 制作工作曲線 取單胞藻液20ml置于比色管中，并稀釋成5個(gè)濃度梯度（建議第一濃度是第二濃度的2倍，依次類推），以培養(yǎng)液作為參比，用分光光度計(jì)分別測(cè)定其吸光度（O.D.），并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定相應(yīng)藻液的藻細(xì)胞個(gè)體濃度，由于藻細(xì)胞濃度與吸光值的大小成正比關(guān)系，根據(jù)5組數(shù)據(jù)繪出

4、吸光度-藻細(xì)胞濃度的相關(guān)曲線，即工作曲線。1.1 用培養(yǎng)液作為參比，分別測(cè)定相應(yīng)的5個(gè)濃度梯度藻液的吸光度（綠色的藻類一般選擇的波長為720-750nm；金藻門藻類、硅藻門藻類一般選擇的波長為420nm）。1.2 用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)工作曲線用的藻細(xì)胞濃度。 把血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片擦洗清潔、平放在桌上、并蓋好蓋玻片。搖勻工作曲線用的藻液，用一支干凈的平口微吸管吸取藻液，迅速把吸管放在計(jì)數(shù)板旁的蓋玻片邊緣處，輕壓橡皮頭，使藻液流入計(jì)數(shù)板內(nèi)（如果樣品是有運(yùn)動(dòng)能力的種類，則應(yīng)加入碘液殺死，才能取樣計(jì)數(shù)）。 稍停一分鐘后，在低倍鏡下（細(xì)胞太小需用40×10倍）計(jì)數(shù)中央大格（400個(gè)小格）和東北

5、、西北、西南、東南等4個(gè)大格（16個(gè)中格），每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)兩次，然后取其平均值。得：1ml水體的藻類細(xì)胞數(shù)目=計(jì)數(shù)平均值×稀釋倍數(shù)×10000個(gè)（簡(jiǎn)記：萬個(gè)/ml）2測(cè)定被測(cè)藻液的吸光度。3根據(jù)工作曲線求出藻液相應(yīng)吸光度的藻細(xì)胞濃度（或由公式：被測(cè)藻液的藻細(xì)胞濃度=工作曲線中總的藻細(xì)胞濃度/工作曲線中總的吸光度×被測(cè)藻液的藻細(xì)胞吸光度）?！咀⒁馐马?xiàng)】1.血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，藻液不能溢出蓋玻片上方，若有溢出，需沖洗干凈，重新取樣，注意控制藻液流入量，不能過多，也不能過少，應(yīng)充滿計(jì)數(shù)板的部分，不能有氣泡。2.應(yīng)注意搖勻后，再取樣進(jìn)行測(cè)定或計(jì)數(shù)。3.如果藻細(xì)胞濃度太大，

6、應(yīng)稀釋后才計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。4.運(yùn)動(dòng)的藻類，應(yīng)殺死后才能計(jì)數(shù)。（建議：稀釋液中含有固定液）【作業(yè)與思考】1.繪制工作曲線。2.計(jì)算出你測(cè)定的單細(xì)胞藻的細(xì)胞密度。3.你是如何減少計(jì)數(shù)所造成的誤差？實(shí)驗(yàn)二 單細(xì)胞藻培養(yǎng)的容器、工具與用水的消毒【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)單細(xì)胞藻的容器工具及用水的消毒方法，為今后成功培養(yǎng)單細(xì)胞藻打基礎(chǔ)?！緦?shí)驗(yàn)原理和基礎(chǔ)知識(shí)】單細(xì)胞藻培養(yǎng)用的工具、容器及水都必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒，盡可能殺死一切生物，以免污染影響藻類生長和繁殖?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、實(shí)驗(yàn)器材 儀器設(shè)備：恒溫干燥箱、電爐、電子天平、充氣泵。工具容器： 250ml三角燒瓶（每人2只） 400ml燒杯30只

7、3000ml三角燒瓶10只 (6人/組) 攪拌棒 20根移液管（5或10ml） 30支 塑料桶 4個(gè)移液管（1ml） 30支 乳膠管 若干容量瓶（100ml） 30只 量筒100ml 30只二、藥品 濃硫酸、重鉻酸鉀、漂白水或次氯酸鈉溶液、硫代硫酸鈉。洗液的配制方法：稱15g重鉻酸鉀至干燥的燒杯中，然后加入200ml粗硫酸，攪拌并加熱至重鉻酸鉀溶解，即得洗液，冷卻后將上清液倒入試劑瓶中備用。三、實(shí)驗(yàn)材料 海水200L、淀粉碘化鉀試紙2包、充氣管、充氣石10粒。【實(shí)驗(yàn)操作步驟】一、工具、容器消毒方法 1洗液消毒法 所有待用三角瓶、燒杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自來水（加去污粉）沖刷干凈，然后倒入少

8、許洗液，沿著內(nèi)壁慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)器皿，使其全部浸泡，放置10min后，將底部洗液回收（以備后用），然后用自來水沖凈瓶子，把瓶口朝下晾干。移液管應(yīng)用洗耳球吸取洗液，使其浸泡內(nèi)壁，10min后，用自來水沖凈內(nèi)、外壁。2烘箱干熱消毒法 將洗凈、涼干的玻璃器皿（移液管、金屬工具等應(yīng)用報(bào)紙或牛皮紙包扎好），扎瓶口用的紙，棉塞均放入烘箱。打開通氣孔，接通電源，加熱，待溫度上升至120時(shí)關(guān)閉通氣孔（在升溫過程中，如果綠燈熄滅，紅燈亮，表示箱內(nèi)停止加熱），恒溫2h后，斷電停止加熱，然后待溫度自然冷卻至60以下，才能打開烘箱門取出容器、工具（實(shí)驗(yàn)室保種通常并用洗液消毒法和加熱消毒法）。3煮沸消毒 小型的容器、工具可放入

9、鍋中，加水煮沸消毒15-30min，可殺死細(xì)菌的營養(yǎng)體，如果在水中加入2%Na2CO3可促使芽孢死亡。較大的三角燒瓶，可在瓶內(nèi)加少量淡水，套上紙或放一只普通的玻璃漏斗，煮沸消毒15-30min，可使整個(gè)瓶壁消毒。然后倒出淡水，蓋上消毒的牛皮紙。二、培養(yǎng)用水的消毒方法 1.脫脂棉過濾法 取一桶海水置于高處，接好過濾裝置、然后控制夾子，慢慢滴水過濾2L。2加熱煮沸消毒法 將經(jīng)脫脂棉過濾的海水，放至電爐燒開，冷卻至室溫（實(shí)驗(yàn)室保種通常并用脫脂棉過濾和加熱煮沸法）。3漂白水消毒法 每人取2L過濾海水加入漂白水（含有效氯10）0.5ml，攪拌均勻后蓋上以防氯氣逸出。靜止放置16-24 h時(shí)消毒后再加入等

10、量硫代硫酸鈉中和，充氣2 h，然后用淀粉碘化鉀試紙測(cè)試是否有余氯（單胞藻二級(jí)培養(yǎng)、三級(jí)培養(yǎng)常用）。試紙無變藍(lán)表明無余氯存在，即可使用。【注意事項(xiàng)】1.用加熱法消毒培養(yǎng)用水時(shí)，三角瓶內(nèi)的水量不能超過瓶子的2/3，瓶外面不能有水珠，瓶口用紙蓋住，不要綁緊。2.洗液在瓶子內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，注意瓶口不能對(duì)著自己，也不能對(duì)著他人。3.干熱滅菌過程中，實(shí)驗(yàn)者不能離開，嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。4.烘箱內(nèi)的溫度需冷卻至60以下，才能打開烘箱門取出工具、容器?！咀鳂I(yè)與思考】1. 培養(yǎng)單細(xì)胞藻的工具、容器的消毒有哪幾種方法？2. 單細(xì)胞藻培養(yǎng)用水的消毒有哪幾種方法？3. 單細(xì)胞藻藻種應(yīng)如何保藏？實(shí)驗(yàn)三

11、單細(xì)胞藻培養(yǎng)液-母液的配制【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握培養(yǎng)液配制的原理、一般方法和步驟，為今后成功培養(yǎng)單細(xì)胞藻打基礎(chǔ)。【實(shí)驗(yàn)原理和基礎(chǔ)知識(shí)】 單細(xì)胞藻大量生長繁殖，必須從環(huán)境中吸收各種營養(yǎng)元素，包括氮、磷、鐵和微量元素等單細(xì)胞藻在不同配方的培養(yǎng)液中生長效果不同，因此要根據(jù)各種單細(xì)胞藻的生理需求選擇合適的培養(yǎng)液。把營養(yǎng)元素根據(jù)培養(yǎng)液配方進(jìn)行高濃度配合（而且稀釋液用蒸餾水或去離子水），一般濃縮1000倍，配成母液。目的是培養(yǎng)方便，母液不能直接用于培養(yǎng)單細(xì)胞藻類，必須稀釋后才用。一般每升消毒海水或淡水中加入1ml母液，即為培養(yǎng)液?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、實(shí)驗(yàn)器材 電子天平、電爐、容量瓶、燒杯、攪拌棒、試劑瓶、100m

12、l量筒、吸管、10ml移液管、耳球、微量注射器。 二、藥品 NaNO3、（NH2）2CO、KH2PO4、FeSO4.7H2O、MnSO4、EDTA-Na2、VB1、VB12、Na2SiO3 。三、實(shí)驗(yàn)材料 蒸餾水【實(shí)驗(yàn)操作步驟】1“寧波大學(xué)3號(hào)”培養(yǎng)液配方（母液）NaNO3 100g FeSO4.7H2O 2.5g KH2PO4 10g MnSO4 0.25g EDTA-Na2 20g VB1 60mgVB12 50µg 蒸餾水 1000ml培養(yǎng)海水綠藻類、金藻類、硅藻類等使用。在培養(yǎng)硅藻時(shí)在此基礎(chǔ)上加入0.02g/L Na2SiO3，培養(yǎng)螺旋藻時(shí)應(yīng)加2g/L的NaHCO3 。2.配

13、制步驟： （1）稱量和溶解配制母液100ml。按配方先稱取NaNO3放入干凈的燒杯中，加入約60ml蒸餾水，攪拌使NaNO3 完全溶化。然后再依次稱取其他各成分，逐一溶解，最后一起倒入100ml容量瓶，再用蒸餾水沖洗燒杯2-3次，并轉(zhuǎn)移到容量瓶中，最后用蒸餾水加至刻度。（在本配方中FeSO4、MnSO4應(yīng)與EDTA-Na2一起加熱溶解）（2）壓緊容量瓶蓋，將容量瓶上下顛倒n次，使其混合均勻，倒進(jìn)經(jīng)消毒的試劑瓶內(nèi)，并貼上標(biāo)簽（母液名稱、配制人、日期）。（3）配制0.5% Na2SiO3 稱0.5g Na2SiO3 置于干凈的燒杯中，加入約60ml蒸餾水，攪拌溶解，倒進(jìn)100ml容量瓶，用蒸餾水沖

14、洗燒杯2-3次并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容100ml。上下顛倒容量瓶n次，使其混合均勻，倒進(jìn)經(jīng)消毒的試劑瓶內(nèi)，并貼上標(biāo)簽（貯液名稱、濃度、配制人、日期）?！九渲颇敢簯?yīng)注意事項(xiàng)】 1.各種營養(yǎng)鹽應(yīng)逐一稱量、逐一溶解，倒進(jìn)容量瓶定容，然后再倒入試劑瓶保存。2.稀釋液必須加蒸餾水或去離子水。3.難溶解的物質(zhì)必須與EDTA-Na2 一起絡(luò)合加熱溶解。4.待溫度冷卻至低于60時(shí)，才能加入維生素，以免失效。5.注意加入燒杯中溶化營養(yǎng)鹽的水量應(yīng)少于所需要定容的水量?！咀鳂I(yè)與思考】1單細(xì)胞藻類培養(yǎng)液配制的操作過程中應(yīng)注意什么問題？2單細(xì)胞藻類的全培養(yǎng)液配方應(yīng)包含哪些成分?3試述該配方中的N、P比是多少？ 實(shí)驗(yàn)四 單

15、細(xì)胞藻一級(jí)培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆諉渭?xì)胞藻一級(jí)培養(yǎng)的基本操作與管理，從而有可能做到有計(jì)劃地培養(yǎng)足夠數(shù)量的符合質(zhì)量的單細(xì)胞藻。【實(shí)驗(yàn)原理和基礎(chǔ)知識(shí)】單細(xì)胞藻在適宜的生態(tài)條件下可以生長繁殖，在不同配方的培養(yǎng)液中生長效果不同，因此要根據(jù)各種單細(xì)胞藻的生理需求選擇合適的生態(tài)環(huán)境和營養(yǎng)鹽進(jìn)行培養(yǎng)?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、實(shí)驗(yàn)器材 恒溫干燥箱、250ml三角燒瓶、電爐、溫度計(jì)、鹽度計(jì)、3000m燒瓶、10m移液管、100ml量筒、扎瓶口的牛皮紙、橡皮圈、長鑷子、剪刀、標(biāo)簽紙、（配制培養(yǎng)液用：電子天平、電爐、燒杯、攪拌棒、容量瓶、試劑瓶）。二、試劑 固定液、寧波大學(xué)3號(hào)母液、洗液。三、實(shí)驗(yàn)材料 小球藻2000ml、扁藻

16、2000ml、等邊金藻2000ml、消毒海水?！緦?shí)驗(yàn)操作步驟】1.培養(yǎng)容器、工具的消毒。 各種玻璃器皿先用去污粉刷洗干凈，再用洗液消毒、沖洗干凈后，晾干，放入烘箱120消毒2h，待溫度低于60后才能打開烘箱門取出器皿（提前消毒）。2.煮沸消毒海水。 用脫脂棉過濾海水2000ml于三角燒瓶中，放至電爐燒開，自然冷卻到室溫（提前準(zhǔn)備）。3.用漂白水消毒海水。 取海水2000ml于三角瓶中，加入漂白水0.5ml(含有效氯10%)，混均，蓋上蓋子，避免氯氣逸出，消毒時(shí)間一般為下午5點(diǎn)至次日上午7點(diǎn)，請(qǐng)勿在上午配制和消毒，因光照會(huì)使氯氣分解，影響消毒效果。培養(yǎng)液的還原一般采用消毒液量的10%（如含有效氯

17、10%的1L漂白水，可加入100g克硫代硫酸鈉還原），將稱量好的硫代硫酸鈉用開水溶解后倒入消毒海水中，搖晃使之徹底還原，1-2h后用淀粉碘化鉀試紙測(cè)試是否有余氯，若無余氯即可接種（提前準(zhǔn)備）。4.接種前，先洗凈手，擦干后用75%的酒精棉球消毒。5.在消毒海水中加入3號(hào)母液2ml，搖晃燒瓶，使?fàn)I養(yǎng)鹽擴(kuò)散均勻并恢復(fù)原海水中氣體溶解量。6.用量筒分別量取80ml培養(yǎng)液，加入已消毒的三角燒瓶中，再用移液管移取20ml小球藻（或扁藻、金藻）藻種加入三角燒瓶中。（一般先加培養(yǎng)液，后加藻種）7.搖晃三角燒瓶，用消毒移液管取出5ml接種好的藻液，用于測(cè)定接種藻細(xì)胞濃度N0。8.將培養(yǎng)瓶置于適宜的光照和溫度下進(jìn)

18、行培養(yǎng)管理，每天搖晃2-4次，觀察微藻的生長情況并做好記錄，一周后，再次測(cè)定培養(yǎng)的藻細(xì)胞密度。【注意事項(xiàng)】1.用洗液消毒后的瓶子不能再用刷子刷內(nèi)壁，以免刷子帶來污染物。2.注意所有接觸藻液的工具、容器都必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒。【作業(yè)與思考】1.培養(yǎng)結(jié)束后提交培養(yǎng)報(bào)告，描述單細(xì)胞藻的生長情況。2.在連續(xù)晴天條件下，單細(xì)胞藻在下午或次日早上突然下沉，請(qǐng)你解釋原因并說明應(yīng)采取的措施。3.比較煮沸消毒法與漂白水消毒法的培養(yǎng)效果。 實(shí)驗(yàn)五 輪蟲的分離與培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握輪蟲的分離、馴化及培養(yǎng)管理技術(shù)，為今后成功培養(yǎng)輪蟲打基礎(chǔ)。 【實(shí)驗(yàn)原理和基礎(chǔ)知識(shí)】用小口吸管取輪蟲水樣滴在干凈的載玻片上，排成一排4-6滴

19、，置于解剖鏡或顯微鏡下（4倍或10倍物鏡）觀察，若發(fā)現(xiàn)輪蟲就用小口吸管吸出，放在另一滴過濾海水中清洗并顯微觀察，若發(fā)現(xiàn)有輪蟲而沒有其他浮游動(dòng)物，用小口吸管吸出進(jìn)行培養(yǎng)或用沖水法將輪蟲沖至盛有過濾水樣的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、實(shí)驗(yàn)器材 顯微鏡、pH計(jì)、鹽度計(jì)、浮游生物網(wǎng)、500ml燒杯或玻璃缸、加熱棒、吸管、載玻片、充氣泵、氣石。二、試劑 魯哥氏液 。三、實(shí)驗(yàn)材料 輪蟲水樣、扁藻、等邊金藻、小球藻、角毛藻。【實(shí)驗(yàn)操作步驟】 一、分離培養(yǎng)1.撈取輪蟲 每小組成員用浮游生物網(wǎng)在小蝦（魚）塘中拖網(wǎng)，撈取輪蟲，最好是在清晨，輪蟲向水表層游動(dòng)時(shí)捕撈，效果更好（提前準(zhǔn)備）。2.準(zhǔn)備培養(yǎng)液測(cè)定輪蟲原生活環(huán)境的鹽度、pH值等，用脫脂棉過濾海水1000ml，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)輪蟲用水的鹽度和pH值，使其與原生活環(huán)境的條件相近。將海水分裝在燒杯中，每瓶裝150ml水量。3.分離 用小口吸管取輪蟲水樣滴在干凈的載玻片上，排成一排4-6滴，置于解剖鏡或顯微鏡（10倍或4倍物鏡）下觀察，若發(fā)現(xiàn)輪蟲就用微吸管吸出，放在另一滴過濾海水中清洗并顯微觀察，若發(fā)現(xiàn)有輪蟲而沒有其他浮游動(dòng)物，再次用小口吸管吸出進(jìn)行培養(yǎng)或沖水法（僅含有輪蟲，而沒有其他浮游動(dòng)物）將輪蟲沖至盛有過濾水樣的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，投喂小球