陜西職業(yè)暴露人群監(jiān)測方案年版-陜西疾病預(yù)防控制中心

1、陜西省職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測方案（2011 年版）一、監(jiān)測目的1二、監(jiān)測場所和監(jiān)測點的設(shè)置1三、監(jiān)測內(nèi)容和方法2四、附表和附錄5附表 1、監(jiān)測點信息登記表.6附表 2、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷.7附表 3、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本采樣登記表.9附表 4、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本送檢單.11附表 5、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本檢測結(jié)果表.12附表、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表14附表、環(huán)境標(biāo)本核酸檢測結(jié)果登記表15附表 8、環(huán)境標(biāo)本病毒分離、鑒定結(jié)果登記表.16附表、環(huán)境標(biāo)本送檢單17附表 10 、環(huán)境標(biāo)本分離毒株送檢單.16附錄 1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸.17附錄 2、全省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗

2、室名單編號.20附錄 3、實驗室操作方法簡介.20陜西省職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測方案（2011 年版）2009 年由一種新的人、禽、豬流感病毒重配而來的甲型 H1N1 流感病毒所導(dǎo)致的流感大流行， 再一次證明流感病毒的重配， 并由新的重配病毒導(dǎo)致流感大流行是不可避免的。 因此盡管此次流感大流行已經(jīng)結(jié)束，但如何應(yīng)對由其它新型病毒所導(dǎo)致的一場新的流感大流行仍是我們的重要任務(wù)。 高致病性 H5N1 禽流感病毒仍然在很多國家和地區(qū)導(dǎo)致動物疫情， 人感染病例也一直在不斷發(fā)生， 因此由其導(dǎo)致流感大流行的警報并沒有解除。 2008 年以來，在衛(wèi)生部每年中央財政轉(zhuǎn)移支付 SARS 、人禽流感防治項目專項

3、經(jīng)費(fèi)的支持下， 各省均安排了禽流感職業(yè)暴露人群的血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感病原學(xué)監(jiān)測工作。通過此項工作不僅有效地提高了我國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的檢測能力，在 2009 年甲型 H1N1 流感的防控中發(fā)揮了重要作用，而且通過及時分析H5N1 禽流感病毒的變異情況以及在職業(yè)暴露人群中的感染狀況的變化，可以進(jìn)一步監(jiān)測感染來源，確定感染高危因素，監(jiān)測禽流感病毒致病力和傳播能力的改變，為流感大流行的預(yù)警提供了依據(jù)。為進(jìn)一步規(guī)范此項工作，繼續(xù)做好流感大流行的預(yù)測預(yù)警，持續(xù)提高我省應(yīng)對流感大流行的能力，在前期工作的基礎(chǔ)上， 結(jié)合目前我省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展現(xiàn)狀，重新修定了陜西省職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽

4、流感監(jiān)測方案（2011 年版），用于指導(dǎo)全省的監(jiān)測工作。一、監(jiān)測目的1. 了解職業(yè)暴露人群中高致病性H5N1 禽流感病毒感染變化狀況。2. 了解高致病性 H5N1 禽流感病毒在環(huán)境中的分布情況。3監(jiān)測高致病性H5N1 禽流感病毒的變異情況。二、監(jiān)測場所和監(jiān)測點的設(shè)置（一）監(jiān)測點所在地區(qū)的選擇優(yōu)先選擇滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一的地區(qū)設(shè)立監(jiān)測點：1. 該城市或縣城所轄或周邊地區(qū)曾經(jīng)發(fā)生過人和 /或動物高致病性 H5N1 禽流感疫情；2. 周邊地區(qū)湖泊、河流等水體分布比較密集，水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)；3. 境內(nèi)為候鳥棲息地或候鳥遷徙路線。（二）監(jiān)測場所和監(jiān)測點的選擇根據(jù)各地區(qū)的特點， 各設(shè)區(qū)市疾控中心根據(jù)具體情況選擇

5、兩類及1以上監(jiān)測場所設(shè)立監(jiān)測點。1城鄉(xiāng)活禽市場：每家活禽市場為一個監(jiān)測點。2家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶） ：每家家禽規(guī)模養(yǎng)殖場為一個監(jiān)測點。3家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)：每個自然村為一個監(jiān)測點。4家禽屠宰加工廠：每家家禽屠宰加工廠為一個監(jiān)測點。5野生禽鳥棲息地：一個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（或縣區(qū)）所轄的野生禽鳥棲息地作為一個監(jiān)測點。各設(shè)區(qū)市選擇監(jiān)測地區(qū)、 監(jiān)測場所和監(jiān)測點后將監(jiān)測點基本信息上報?。ㄒ姼奖?1），由省 CDC 錄入“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)”。采集職業(yè)暴露人群血清時，同時在該監(jiān)測點采集一次環(huán)境標(biāo)本，即采集的職業(yè)暴露人群血清要有該監(jiān)測點的環(huán)境標(biāo)本與之對應(yīng)。三、監(jiān)測內(nèi)容和方法（一）職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測

6、1. 監(jiān)測對象（ 1）活禽批發(fā)市場、城鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場或菜市場中直接與禽類接觸的人員。（ 2）家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶）中直接與禽類接觸的人員。（ 3）家禽散養(yǎng)戶的家庭成員。（ 4）家禽屠宰加工廠中直接與禽類接觸的人員。（ 5）野生候鳥棲息地中與候鳥或其排泄物有接觸的人員。2. 監(jiān)測時間每年冬春季 (每年 10 月至次年 3 月)各開展一次職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測。3. 監(jiān)測內(nèi)容與方法（1）流行病學(xué)調(diào)查收集調(diào)查對象的基本情況、禽類接觸史等內(nèi)容，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷” （見附表2），確保調(diào)查問卷與血清標(biāo)本嚴(yán)格的一一對應(yīng)關(guān)系，調(diào)查問卷、血清標(biāo)本登記表、血清采樣管上的血清標(biāo)本編號務(wù)必保

7、持一致。調(diào)查問卷在調(diào)查完成后1 周內(nèi)上交省 CDC ，由省 CDC 錄入“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)”，西安市自行錄入。（2）標(biāo)本采集、運(yùn)送采集監(jiān)測對象的空腹靜脈血5ml （見附錄 1），填寫“職業(yè)暴露人2群血清標(biāo)本采樣登記表”（見附表 3），在登記表上手寫記錄血清標(biāo)本編號或粘貼打印的血清標(biāo)本編號條形碼， 同時確保調(diào)查問卷、 血清標(biāo)本登記表、血清采樣管上的血清標(biāo)本編號要一致。 血清標(biāo)本編號規(guī)則：（ 1）血清標(biāo)本代號： B；（2）年份后兩位；（3）網(wǎng)絡(luò)實驗室編號（三位）（見附錄 2）；(4) 實驗室標(biāo)本編號：從 001 開始。西安市 CDC 每年采集 70 份血清標(biāo)本，銅川 CDC 每年采集

8、 25 份血清標(biāo)本，楊凌區(qū) 15 份血清標(biāo)本，其他各設(shè)區(qū)市每年采集 40 份，每年二月底之前完成采集。分離后的血清， 在無菌條件下分裝為 3 份，全部送省 CDC 復(fù)核。血清標(biāo)本應(yīng)置 20或以下凍存， 避免反復(fù)凍融。 標(biāo)本采集完成后 1周內(nèi)連同職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本送檢單（附表 4）送省 CDC ，由省 CDC 錄入“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)” “暴露人群血清監(jiān)測模塊”。西安市自行錄入信息。 標(biāo)本運(yùn)輸時遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（ 3）實驗室檢測：各地市選派實驗室人員參加由省 CDC 統(tǒng)一組織的血清標(biāo)本 H5N1 抗體初篩檢測工作。標(biāo)本采集后要求 1 個月內(nèi)完成檢測工作，填寫“職業(yè)暴露人

9、群血清標(biāo)本檢測結(jié)果表” （見附表5）。（二）環(huán)境標(biāo)本高致病性禽流感病原學(xué)監(jiān)測1、監(jiān)測對象監(jiān)測點的水、禽類（含候鳥）糞便及籠具表面殘存物等環(huán)境標(biāo)本。2、監(jiān)測時間全年監(jiān)測，每月監(jiān)測 1 次。每次須提前幾天了解監(jiān)測點的情況，避免在監(jiān)測點消毒后 2 日內(nèi)采樣。3、監(jiān)測方法（1）標(biāo)本采集各監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室每月至少采集標(biāo)本 1 次，每次采集各類標(biāo)本至少 5 份，每個監(jiān)測點可包括 2-3 個采樣點，采集的環(huán)境標(biāo)本可包括禽類糞便、籠具表面擦拭標(biāo)本等多個種類（具體見附錄 1），在采集標(biāo)本的同時填寫“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”（附表），在登記表上手寫記錄環(huán)境標(biāo)本編號或粘貼打印的環(huán)境標(biāo)本編號條形碼， 確保環(huán)境標(biāo)本登記表、環(huán)

10、境采樣管上的環(huán)境標(biāo)本編號要一致。環(huán)境標(biāo)本編號原則： （1）環(huán)境標(biāo)本代號 ： ；（2）年份后兩位；（3）網(wǎng)絡(luò)實驗室編號 （三位）（見附錄 2）；(4) 實驗室標(biāo)本編號：從 001 開始。3環(huán)境標(biāo)本采樣點的設(shè)置和定義:城鄉(xiāng)活禽市場：活禽市場每個攤位為一個采樣點。家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶）：家禽規(guī)模養(yǎng)殖場每間（排）禽舍為一個采樣點。家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)：每個家禽散養(yǎng)戶為一個采樣點。家禽屠宰加工廠：家禽屠宰加工廠每個屠宰/加工間為一個采樣點。野生禽鳥棲息地：根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r，在監(jiān)測點不同方位 /位置的地點為一個采樣點。（2）標(biāo)本運(yùn)輸、處理標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下 48 小時內(nèi)運(yùn)送至監(jiān)測實驗室。實驗室收到標(biāo)本后應(yīng)立

11、即進(jìn)行標(biāo)本處理（見附錄 1），并將標(biāo)本分為 3 份， 1 份用于核酸檢測，1 份用于病毒分離，1 份留樣備送檢（至少 1.5ml ）。標(biāo)本采集后 1 周內(nèi)將“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”送至省CDC ，由省 CDC 將信息錄入到“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)” “禽流感環(huán)境監(jiān)測模塊”，西安市自行錄入上述信息。 留樣標(biāo)本要求在 70或以下凍存。標(biāo)本運(yùn)輸時遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（3）實驗室檢測各流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測實驗室收到標(biāo)本后 1 周內(nèi)對標(biāo)本進(jìn)行流感病毒 A 型核酸檢測， A 型流感病毒核酸陽性的標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行 H5 、H7 、H9亞型檢測，填寫“環(huán)境標(biāo)本核酸檢測結(jié)果登記表”（附表），檢測結(jié)果請在一個

12、月內(nèi)上送至省 CDC ，由省 CDC 將結(jié)果錄入到 “傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)” ，西安市自行錄入。各監(jiān)測實驗室如具備 BSL-3 生物安全實驗室可開展 H5 和 H7 亞型高致病性禽流感病毒分離工作，填寫“環(huán)境標(biāo)本病毒分離、鑒定結(jié)果登記表”（附表），檢測結(jié)果送交省 CDC 錄入到 “傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺信息管理系統(tǒng)”，西安市自行錄入。所有陽性標(biāo)本和病毒的運(yùn)輸按照國家關(guān)于高危病原微生物運(yùn)輸管理的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。在檢測后 2 周內(nèi)將所有A 型流感病毒核酸陽性標(biāo)本的備存標(biāo)本（1.5ml ） 送省 CDC ，同時在信息系統(tǒng)上進(jìn)行網(wǎng)上送檢，送省CDC的標(biāo)本須附上信息系統(tǒng)生成的環(huán)境標(biāo)本送檢單（附表9）

13、。各監(jiān)測實驗室分離的病毒在 1 周內(nèi)送省 CDC ，同時在信息系統(tǒng)上進(jìn)行網(wǎng)上送檢，上送的毒株須附上信息系統(tǒng)生成的環(huán)境標(biāo)本分離毒株送檢單 （附4表 10）。(三)匯報總結(jié)各地市每季度應(yīng)撰寫季度監(jiān)測報告，并于每季度末交至省 CDC 。四、附表和附件附表 1、監(jiān)測點信息登記表附表 2、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷附表 3、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本采樣登記表附表 4、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本送檢單附表、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本檢測結(jié)果表附表、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表附表、環(huán)境標(biāo)本核酸檢測結(jié)果登記表附表、環(huán)境標(biāo)本病毒分離、鑒定結(jié)果登記表附表、環(huán)境標(biāo)本送檢單附表 10、環(huán)境標(biāo)本分離毒株送檢單附錄 1、標(biāo)本的采集、處

14、理、保存與運(yùn)輸附錄 2、全省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室名單編號附錄 3、實驗室操作方法簡介5附表 1、監(jiān)測點信息登記表監(jiān)測點名稱監(jiān)測點詳細(xì)地址監(jiān)測場所種類涉及禽、鳥種類（詳述）涉及禽、鳥來源調(diào)查當(dāng)天監(jiān)測點禽鳥保有量監(jiān)測點面積估計值從業(yè)人數(shù)數(shù)量通常的防護(hù)情況近期禽、鳥免疫情況近期禽鳥發(fā)病情況整體環(huán)境情況（包括環(huán)境衛(wèi)生、布局、工作分區(qū)）日常環(huán)境清潔和安全措施（包括清潔的頻率， 動物糞便處理）最后一次消毒日期（若從不消最后一次使用的毒，請?zhí)睢盁o）”消毒劑備注監(jiān)測點種類1 城鄉(xiāng)活禽市場2 家禽規(guī)模養(yǎng)殖場 （戶） 3 家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)4 家禽屠宰加工廠 5 野生候鳥棲息地6 其它6附表 2、職業(yè)暴露人群血清

15、流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷省市縣編碼血清標(biāo)本編號一、一般情況1、姓名：（電話：）2、性別：男性女性3、年齡：周歲4、現(xiàn)住址：5、職業(yè)：幼托兒童散居兒童學(xué)生（大中小學(xué)）教師保育員及保姆餐飲食品業(yè)商業(yè)服務(wù)醫(yī)務(wù)人員工人10民工 11農(nóng)民 12牧民13漁（船）民 14干部職員15離退人員16家務(wù)及待業(yè)17其他18不詳二、暴露情況 （可多選）6、職業(yè)暴露人群種類：散養(yǎng)戶規(guī)?；B(yǎng)殖場從業(yè)人員活禽批發(fā)市場人員 農(nóng)貿(mào)市場或菜市場活禽交易人員家禽屠宰加工廠人員野生候鳥棲息地接觸鳥類人員其他7、暴露方式：喂養(yǎng)清掃禽舍加工（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪）食用捕殺運(yùn)輸捕捉銷售其他8、如為養(yǎng)殖人員，禽類養(yǎng)殖方式：散養(yǎng)圈養(yǎng)9、

16、近一個月來，接觸禽種類：雞鴨鵝鴿子野禽其他710 、近一個月以來，是否接觸過病死禽？是否【跳至 12 題】不詳【跳至 12 題】（1）病死禽種類：雞鴨鵝鴿子其他（2）接觸方式為：（可多選）喂養(yǎng)清掃禽舍加工（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪）食用捕殺運(yùn)輸捕捉其他（3）接觸病死禽時是否有防護(hù)措施？是否【跳至（ 4）】不詳【跳至（ 4）】如果有，采取的措施有：（可多選）戴口罩（ N95 口罩、過濾口罩、棉紗口罩、一次性外科口罩）戴面罩穿防護(hù)服（規(guī)范、不規(guī)范） 防護(hù)眼鏡手套帽子白大衣其它（4）接觸病死禽的持續(xù)時間：天（月日到月日）累計暴露：小時11 、近 1 個月是否出現(xiàn)過發(fā)熱？是否8調(diào)查人員單位：調(diào)查人

17、員：調(diào)查日期：審核人員：審核日期：9附表 3、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本采樣登記表監(jiān)測實驗室：監(jiān)測實驗室編號 §：監(jiān)測場所種類 #：監(jiān)測點名稱：血清標(biāo)本編號姓名年齡性別采樣日期血液標(biāo)本量 (ml)備注注： 血清標(biāo)本編號原則： （ 1 ）血清標(biāo)本代號 ： B ；（ 2 ）年份后兩位；（ 3）網(wǎng)絡(luò)實驗室編號 (三位 )；(4) 實驗室標(biāo)本編號 從 001 開始。例如北京市疾病預(yù)防控制中心 2011 年采集的標(biāo)本 B11001001 ，浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心 2011 年采集的標(biāo)本 B11022001 。#監(jiān)測場所種類選擇：城鄉(xiāng)活禽市場；家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶）；家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)；家禽屠宰加工

18、廠；野生候鳥棲息地。§為避免現(xiàn)場填寫血清標(biāo)本編號出錯，請?zhí)崆疤顚憣嶒炇揖幪?。采集人：采集單位：送檢日期：年月日10附表 4、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本送檢單送檢單編號（自動生成） ：送檢日期：年月日送檢單位（蓋章）：血清標(biāo)本編號姓名年齡性別采樣日期送檢的血清標(biāo)備注標(biāo)本狀態(tài) #本量 (ml) *注： #標(biāo)本狀態(tài)：溶血；乳糜血；黃疸；血清量少,不足 1ml 。* 送檢的血清標(biāo)本量：請在送檢時填寫。11附表 5、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本檢測結(jié)果表血清標(biāo)本編號采樣日期收樣日期檢測方法 #檢測結(jié)果檢測結(jié)果備注HI 滴度或 SRH 直徑抗原 2HI 滴度或抗原 1SRH 直徑陽性對照12注： #檢測方法：

19、馬血球HI ；SRH 。檢測單位：檢測者：檢測日期：年月日審核者：13附表、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表監(jiān)測實驗室名稱：監(jiān)測實驗室編號 ：監(jiān)測場所種類 # ：監(jiān)測點名稱：采樣點采樣點描述標(biāo)本種類 *如果為其他類型標(biāo)采集標(biāo)本量備環(huán)境標(biāo)本編號&采樣點名稱采樣時間編號（包括禽的種類）（請選擇）本，請說明（ ml 或 g）注注： &環(huán)境標(biāo)本編號原則： （ 1 ）環(huán)境標(biāo)本代號： C ；（ 2 ）年份后兩位； （ 3）網(wǎng)絡(luò)實驗室編號（三位） ；(4) 實驗室標(biāo)本編號 從 001 開始。例如北京市疾病預(yù)防控制中心 2011 年采集的標(biāo)本 C11001001 ，浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心 2011 年采集

20、的標(biāo)本 C11022001 。 為避免現(xiàn)場填寫環(huán)境標(biāo)本編號出錯，請?zhí)崆疤顚憣嶒炇揖幪枴?監(jiān)測場所選項： 城鄉(xiāng)活禽市場； 家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶） ； 家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)； 家禽屠宰加工廠； 野生候鳥棲息地。*標(biāo)本種類選項： 籠具表面擦拭標(biāo)本； 宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標(biāo)本；糞便標(biāo)本； 清洗禽類的污水； 禽類飲水； 其他。采集人：采樣單位：聯(lián)系方式：送檢日期：年月日14附表、環(huán)境標(biāo)本核酸檢測結(jié)果登記表檢測單位：環(huán)境監(jiān)測點采樣點檢測日核酸核酸檢測結(jié)果 *采集日期標(biāo)本種類備注標(biāo)本編號名稱名稱期檢測方法 #A 型H5H7H9其他注： *：選項： +（陽性）、可疑+（可疑陽性）、-（陰性）、未（未檢測

21、）。#： One-step PCR； Real-time PCR。操作者：復(fù)核者：15附表 8、環(huán)境標(biāo)本病毒分離、鑒定結(jié)果登記表檢測單位：傳代史 核酸核酸檢測結(jié)果*環(huán)境接種日血球類毒株名稱收樣日期MDCK 細(xì)收獲日期HA 滴度 $檢測方法A鑒定日期標(biāo)本編號期雞胚型%H5H7H9其他&胞#型注： *：選項： +（陽性）、可疑 +（可疑陽性） 、-（陰性）、未（未檢測） 。#： One-step PCR； Real-time PCR。16傳代史：分別填寫E1 、 E2 和 C1 、C2 $ HA 滴度： 2 的倍數(shù)或陰性。% 血球類型：雞紅細(xì)胞；人紅細(xì)胞； 豚鼠紅細(xì)胞。&毒株名稱：

22、型別（A ） /環(huán)境標(biāo)本種類 /采集地（省份） /網(wǎng)絡(luò)實驗室編號 +標(biāo)本順序號 /年代（亞型） ,例如 A/ 糞便 /上海 /021007/2001（ H5N1 ）操作者：復(fù)核者：附表、環(huán)境標(biāo)本送檢單送樣網(wǎng)絡(luò)實驗室：送樣時間：年月日監(jiān)測點名采樣點名核酸檢測核酸檢測結(jié)果 *標(biāo)本編號采集日期標(biāo)本種類檢測日期備注稱稱方法#A型H5H7H9其他17注： *：選項： +（陽性）、可疑 +（可疑陽性） 、-（陰性）、未（未檢測） 。#： One-step PCR； Real-time PCR。送檢人簽字：聯(lián)系電話：注：標(biāo)本采集管必須使用塑料管，避免運(yùn)輸或保存過程造成采樣管破裂。附表 10、環(huán)境標(biāo)本分離毒株

23、送檢單送樣網(wǎng)絡(luò)實驗室：送樣時間：年月日標(biāo)本編號收樣日期接種日期傳代史 收獲日期HA 滴度 $血球核酸核酸檢測結(jié)果*毒株名稱鑒定日期18類型檢測方法#A&MDCK 細(xì)胞雞胚H5H7H9其他型注： *：選項： +（陽性）、可疑 +（可疑陽性） 、-（陰性）、未（未檢測） 。#： One-step PCR； Real-time PCR。傳代史：分別填寫E1 、 E2 和 C1 、C2 $ HA 滴度： 2 的倍數(shù)或陰性。血球類型：雞紅細(xì)胞；人紅細(xì)胞；豚鼠紅細(xì)胞。&毒株名稱：型別（A）/環(huán)境標(biāo)本種類 /采集地（省份）/網(wǎng)絡(luò)實驗室編號+ 標(biāo)本順序號 /年代（亞型） ,例如 A/ 糞便 /

24、上海 /021007/2011 （ H5N1 ）。標(biāo)本采集管必須使用塑料管，避免運(yùn)輸或保存過程造成采樣管破裂。送檢人簽字：聯(lián)系電話：19附錄 1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸一、血清標(biāo)本的采集、處理和運(yùn)輸（一）血清標(biāo)本的采集采集監(jiān)測對象空腹靜脈血5mL 。（如果存在困難，可考慮在飯后2 小時后采血），使用真空負(fù)壓采血套裝管或注射器均可，同時做好標(biāo)記，采集后填寫附表3。（二）血清標(biāo)本的處理和保存1. 如采集當(dāng)日不能及時對標(biāo)本進(jìn)行處理，則可將采血管放 4過夜，標(biāo)本在 4過夜放置后血清會自然析出， 次日直接離心即可， 2000rpm 3000rpm 離心 10min 。如有個別未析出血清的，可將血清

25、采樣管放置于37水浴鍋或 37培養(yǎng)箱內(nèi) 30min-1h 后再離心。2. 如當(dāng)日即可處理血清標(biāo)本， 則將血清采樣管放置于 37 水浴鍋或 37 培養(yǎng)箱內(nèi) 30min-1h ，使血清析出。 血清析出后， 2000rpm 3000rpm 離心 10min 。3. 在生物安全柜內(nèi)分裝血清標(biāo)本。盡可能采用帶外螺旋蓋的凍存管進(jìn)行標(biāo)本分裝，分裝好的標(biāo)本盡可能放置在凍存盒內(nèi)。3.1 根據(jù)采樣登記表上的信息，在凍存管上貼好相應(yīng)的標(biāo)簽。血清標(biāo)本一分為三， 1 份用于省 CDC 統(tǒng)一檢測， 1 份由省 CDC 保存?zhèn)浞荩?1 份送國家流感中心檢測（保證有1mL ）。分裝后的標(biāo)本需置 -20 或以下保存，盡量避免反

26、復(fù)凍融。3.2 血清分裝完成后，填寫附表5。并在監(jiān)測系統(tǒng)中錄入標(biāo)本相關(guān)信息。20（三）血清標(biāo)本的送檢和運(yùn)輸血清標(biāo)本采集后標(biāo)本放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。 同時信息系統(tǒng)上進(jìn)行網(wǎng)上送檢，附加蓋送檢單位公章的送檢單，送檢單應(yīng)單獨(dú)放在防水的袋子里。血清標(biāo)本和環(huán)境標(biāo)本一起運(yùn)至國家流感中心， 相關(guān)程序見環(huán)境標(biāo)本的采集、 處理、保存和運(yùn)輸。二、環(huán)境標(biāo)本的采集、處理、保存和運(yùn)輸（一）標(biāo)本的采集和處理1.采樣液環(huán)境標(biāo)本采樣液可使用Hank's或 Eagle's等培養(yǎng)液加入以下抗菌素和0.5%BSA ：氨芐青霉素(2 x 10 6 I

27、U/L) 、 鏈霉素 (200 mg/L)、多粘菌素B (2 x10 6 IU/L)、 慶大霉素(250 mg/L)、 制霉菌素(0.5 x 10 6 IU/L) 、 鹽酸氧氟沙星 (60 mg/L) 、磺胺甲基異惡唑(200 mg/L) 。2.標(biāo)本種類、采集方法及處理（1）水標(biāo)本在禽類活動或籠具旁的水溝或水池的不同部位共收集水標(biāo)本5-10ml置于15ml外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣標(biāo)本到實驗室后應(yīng)在采樣管中加入上述抗生素和0.5%BSA ，再進(jìn)行分裝。如果采集的水標(biāo)本中存在固體等物質(zhì)，應(yīng)將采集的標(biāo)本在無菌條件下反復(fù)吹打，以便打碎固體物質(zhì)，置4待其自然沉淀30min ，也可 3000rpm 離心 10

28、min ，取上清進(jìn)行分裝。（2）籠具表面標(biāo)本每個籠具采集一份標(biāo)本放在一個單獨(dú)的采樣管中。 用蘸有采樣液的帶有聚丙21烯纖維頭的拭子擦拭籠具表面禽類最常接觸的3-5 個不同部位（包括籠具底部），然后將擦拭過的拭子放入含5ml 采樣液的采樣管中， 尾部棄去。也可以用多個拭子充分擦拭籠具表面后放到一個采樣管中。環(huán)境標(biāo)本要在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎固體，置4待其自然沉淀 30min ，也可 3000rpm離心 10min ，取上清進(jìn)行分裝。（3）宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標(biāo)本如果宰殺或擺放禽肉使用不同的案板，可采集擦拭標(biāo)本放到不同的采樣管中。方法與采集籠具表面擦拭標(biāo)本的方法相同，拭子要

29、擦拭禽肉接觸最多的部位。（4）糞便標(biāo)本從禽舍或環(huán)境中采集新鮮禽類糞便樣品3-5g 左右，放入含 5ml 采樣液的采樣管中。采集的糞便標(biāo)本要在無菌條件下反復(fù)吹打，以便打碎粘液和固體物質(zhì)，置 4待其自然沉淀 30min ，也可 3000rpm 離心 10min ，取上清進(jìn)行分裝。（5）清洗禽類的污水如果有清洗禽類的污水盆或桶，可采集清洗禽類的污水標(biāo)本。將水槽中的水樣用無菌的、一次性的玻璃棒或棉簽充分混勻后采集5-10ml 置于 15ml 外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣標(biāo)本到實驗室后應(yīng)在采樣管中加入抗生素和0.5%BSA ，再進(jìn)行分裝。方法與采集水標(biāo)本相同。（6）禽類飲用水在每個籠具旁的飲水槽采集一份飲用水標(biāo)

30、本。方法與采集清洗禽類的污水標(biāo)本的方法相同。（7）其他22包括地面污水、地面灰塵及籠具墊草等。（二）環(huán)境標(biāo)本保存和送檢環(huán)境可置 4 存放 2 天，存放超過 2 天需置 -70 或以下保存。環(huán)境標(biāo)本處理后， 將原始標(biāo)本分為三份， 一份用于核酸檢測， 一份保存?zhèn)溆?,一份備用送國家流感中心， 送檢量不少于 1.5 ml 。對于核酸檢測陽性的原始標(biāo)本按規(guī)定及時送往國家流感中心。所有標(biāo)本要求-70 或以下保存，在收到國家流感中心復(fù)核鑒定報告后， 病毒分離陽性和病毒分離陰性的標(biāo)本均需按照生物安全有關(guān)規(guī)定處理。5. 標(biāo)本接收送檢的標(biāo)本送到實驗室后， 由專人在生物安全柜內(nèi)打開標(biāo)本的包裝， 記錄收檢日期、送檢

31、實驗室名稱、 核對并記錄送檢標(biāo)本編號是否與送檢單相同。 國家流感中心完成檢測后在監(jiān)測信息系統(tǒng)對送檢單位反饋復(fù)核鑒定結(jié)果， 并根據(jù)送檢單位需要，定期反饋紙質(zhì)報告。如果標(biāo)本運(yùn)輸過程中由于意外不能保證低溫導(dǎo)致標(biāo)本融化，個別標(biāo)本灑漏等情況需及時記錄并反饋網(wǎng)絡(luò)實驗， 如對這些標(biāo)本進(jìn)行檢測需在結(jié)果報告中記錄標(biāo)本意外情況。三、標(biāo)本、調(diào)查表接收聯(lián)系方式接收人：史偉馬萍 許晶 張蕾陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒研究室地址：西安市建東街3 號聯(lián)系電話、傳真：029 82243319QQ 聯(lián)系群：疾控衛(wèi)士家園5437684223附錄 2、全省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室名單編號網(wǎng)絡(luò)實驗室實驗室編號陜西省疾病預(yù)防控制中心076西安

32、市疾病預(yù)防控制中心077銅川市疾病預(yù)防控制中心359寶雞市疾病預(yù)防控制中心360咸陽市疾病預(yù)防控制中心361渭南市疾病預(yù)防控制中心362延安市疾病預(yù)防控制中心363漢中市疾病預(yù)防控制中心364榆林市疾病預(yù)防控制中心365安康市疾病預(yù)防控制中心366商洛市疾病預(yù)防控制中心367楊陵區(qū)疾病預(yù)防控制中心368附錄 3、實驗室操作方法簡介一、馬紅細(xì)胞血凝抑制試驗檢測禽流感抗體（一）生物安全要求禽流感 H5N1 亞型檢測抗原制備和滅活需要在BSL-3 級實驗室進(jìn)行。其余操作均在 BSL-2 級實驗室進(jìn)行。（二）材料1抗原：滅活的H5N1 禽流感病毒。2血清：（ 1）陽性對照血清；陰性對照血清（2）待檢血

33、清。3其他主要試劑：（1）馬紅細(xì)胞（ 1:1 的比例保存于阿氏液中，建議采血后72 小時內(nèi)使用）（2）磷酸鹽緩沖液（ PH 7.2 PBS ）：0.01M ；24（3）牛血清白蛋白（ BSA ）：Sigma A8412 LOT 117K2301（推薦使用）（4）霍亂濾液（ RDE ）：國家流感中心提供4其他：（1）“V” 型 96 孔血凝板（2）37 及 56水浴鍋（3）臺式離心機(jī)（4）多道可調(diào)加樣器（5）離心管（6）EP 管（7）96 孔 PCR 板（處理血清時可以用，推薦使用）（三）質(zhì)量控制1.對照血清每次實驗必須在96 孔板上設(shè)立陽性對照和陰性對照，同批次的陽性對照結(jié)果滴度應(yīng)保持 2 倍

34、以內(nèi)。2.紅細(xì)胞對照實驗可根據(jù)紅細(xì)胞對照來判斷反應(yīng)時間，盡可能在每塊96 孔板上設(shè)計一孔紅細(xì)胞對照（ PBS+1% 紅細(xì)胞懸液）。3. 抗原回滴一個紅細(xì)胞血凝單位指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集時病毒的量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗時一般用4 個紅細(xì)胞血凝單位（指25 L 體積中含有 4 個紅細(xì)胞血凝單位） 的病毒量。每次實驗前， 均須對配置好的含4 個血凝單位的抗25原進(jìn)行回滴，回滴合格后方可使用。（四）實驗步驟1血清處理（1）用單道加樣器吸出1 體積血清置于無菌Eppendorf 管內(nèi)，換滴頭加入4 體積 RDE ，吹打混勻。注：如有細(xì)胞板離心機(jī)，也可使用96 孔 PCR 板對標(biāo)本進(jìn)行批量處理。

35、舉例說明：PCR 板每排可處理 10 份標(biāo)本，在后期實驗中，即可用排槍吸取10份標(biāo)本轉(zhuǎn)移至96 孔血凝板的A1-A10行進(jìn)行倍比稀釋（ A11-A12 設(shè)為陽性對照血清和陰性對照血清） 。（2）置 37水浴 1618h 。（3）從 37水浴鍋取出后將水浴鍋溫度調(diào)至56 水浴， 30min 滅活。（4）馬紅細(xì)胞吸附：瞬時離心，待冷卻后加入清洗后的濃紅細(xì)胞達(dá)20%（每100 LRDE 處理過的血清加入20L 清洗后的濃紅細(xì)胞） ?；靹蚝笫覝匚? h 。（5）2000rpm 離心 3min 。（6）如血清處理后當(dāng)日即可開展標(biāo)本檢測，則直接可用離心后的標(biāo)本進(jìn)行檢測，但吸取血清時須注意勿將紅細(xì)胞吸出。

36、如2-3 天后才能對標(biāo)本進(jìn)行檢測，則需將血清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管或PCR 板中（因吸附血清時留下的紅細(xì)胞放置過久后會出現(xiàn)溶血，影響檢測結(jié)果） ，放 4保存?zhèn)溆谩?馬紅細(xì)胞的采集及1% 馬紅細(xì)胞懸液的配備（1）在注射器里放入一定體積的阿氏液，從頸靜脈處采集馬血后放入容器中，輕柔混勻，如阿氏液不足則需補(bǔ)足（阿氏液和紅細(xì)胞的比例為1:1）。（2）采集的馬紅細(xì)胞應(yīng)放入冰箱4保存，越新鮮越好，建議在采集后7226小時內(nèi)使用。（3）在配置 1% 馬紅細(xì)胞懸液前需清洗紅細(xì)胞液。建議使用含 0.5%BSA 的PBS 清洗和配置 1% 馬紅細(xì)胞懸液。首先加入5mL 紅細(xì)胞（沉積在容器底部的紅細(xì)胞）至 50mL 離

37、心管。加入 45mL PBS-0.5% BSA使總體積達(dá)到 50mL ，輕柔混勻。（4）2000rpm 離心 10 min 。（5）吸掉上清液后，連續(xù)重復(fù)步驟（3） -（4）兩次。（6）配置終濃度為 1% 的馬紅細(xì)胞懸液，如配置100mL 馬紅細(xì)胞懸液，則取 1mL 離心后的紅細(xì)胞加至 99mL PBS-0.5%BSA 中。每次用前輕輕混勻后使用。3. 制備用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗的 4 個紅細(xì)胞血凝單位的抗原（1）將血凝板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1 H1 稱為第一列；平行方向稱行，如 A1 A12 稱為 A 行。標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原及加樣順序。1）吸取 50L PBS 加入血凝板的第二列至

38、最后一列，于第一列加入100 L抗原。272）從第一列取50L 抗原，依次從第二列至第八列做2 倍系列稀釋。最后一列每孔棄去 50 L。3）每孔加入 50 L 1% 馬紅細(xì)胞懸液，輕彈血凝板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。4）室溫孵育 60min 。5）結(jié)果判定：傾斜96 孔血凝板，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞如未凝集，則會成淚滴狀， 且周圍光滑。 紅細(xì)胞凝集滴度的判定以出現(xiàn)凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度。紅細(xì)胞凝集以“+”記錄；無凝集或部分凝集“-”記錄。（2）制備 4 個紅細(xì)胞凝集抗原：首先計算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗所需的病毒抗原的總量。一塊血凝板需要2.5mL 含

39、4 個血凝單位的抗原。根據(jù)參待檢血清的份數(shù)計算出實驗所需病毒抗原量，然后配制抗原。（3）計算出病毒稀釋度。用病毒紅細(xì)胞凝集滴度（HA 滴度）除以 8，得到的商即為 4 個紅細(xì)胞血凝單位的稀釋度。如，某病毒的HA 滴度為 64 ，除以 8等于 8。按 1:8 （1mL 病毒液加 7mL PBS ）稀釋該病毒即可得到4 個血凝單位/25 L 的抗原病毒量。（4）抗原回滴：為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無誤，新配制的 4 個血凝單位抗原須復(fù)核滴定：在血凝板中選取1 列，在第 2-5 孔中加 50ulPBS,，在第一孔中加入100uL稀釋好的抗原，然后吸取50uL 抗原至第 2 孔，

40、倍比稀釋至第5 孔，最后棄掉50uL, 在每孔中加入50 L1% 馬紅細(xì)胞懸液，至室溫孵育60min 后觀察凝集結(jié)28果。如只有前4 孔出現(xiàn)凝集，表明每50 L 病毒含有 8 個血凝單位（即25 L中含有 4 個紅細(xì)胞血凝單位），該病毒稀釋準(zhǔn)確， 可以用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗。如第 5 孔也出現(xiàn)凝集， 說明每 50L 病毒含有 16 個血凝單位（即 25 L 中含有8 個血凝單位），該抗原必須等量稀釋（即補(bǔ)加和第一次配置時相同體積的PBS ）。如只有前 3 孔凝集，表明每50 L 病毒僅含有 4 個血凝單位（即25 L 中含有2 個血凝單位），病毒量需要加倍（即補(bǔ)加和第一次配置時相同體積的病毒）

41、。此外， 4 個血凝單位抗原必須每次用前新配制。4紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）檢測血清抗體將血凝板橫向放置： 垂直方向稱列，如孔A1H1 稱為第一列； 平行方向稱行，如 A1A12 稱為 A 行。標(biāo)記好待檢病毒的實驗室編號及加樣順序。由于職業(yè)人群血清中 H5N1 抗體陽性率較低，故可以將每份血清先做4 孔稀釋進(jìn)行初篩，抗體陽性的標(biāo)本再單獨(dú)進(jìn)行復(fù)核檢測。故除去陽性對照和陰性對照外，每塊血凝板可以檢測 20 份標(biāo)本。（1）每孔加入 25 L PBS 。（2）A11 加入 25L 標(biāo)準(zhǔn)診斷血清作為陽性對照；A12 加入 25 L H5N129陰性血清作為陰性對照。（3）自 A1 孔開始分別加入 25

42、L 待檢血清；（4）先稀釋對照血清，用多道加樣器吸取25L 血清（ A1-A2 ），由 A 行至 H 行做 2 倍系列稀釋血清，至 H 行后棄去 25 L。系列稀釋時需注意每一次稀釋都應(yīng)混合均勻。（5）稀釋待檢血清， 先用多道加樣器吸取 25 L A1-A10 排待檢血清，由 A行至 D 行做 2 倍系列稀釋血清，至 D 行后棄去 25 L。再用多道加樣器吸取25 LE1-E10 排待檢血清，由 E 行至 H 行做 2 倍系列稀釋血清，至 H 行后棄去 25L。系列稀釋時需注意每一次稀釋都應(yīng)混合均勻。（6）每孔中均加入25 L 含 4 個血凝單位的抗原。（7）混勻后室溫孵育20min 。（8）每孔加入50 L 1% 馬紅細(xì)胞懸液，輕彈血凝板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。（9）室溫孵育 60min ，觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果，傾斜96 孔血凝板，紅細(xì)胞如未凝集（凝集抑制），則會成淚滴狀，且周圍光滑。紅細(xì)胞凝集抑制以“+”記錄；凝集或部分凝集“ -”記錄。（10 ）