醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)試驗指導(dǎo)精講

1、普通生物學(xué)實驗指導(dǎo)供醫(yī)學(xué)八年制使用華中科技大學(xué)生命與技術(shù)學(xué)院實驗教學(xué)中心目錄實驗一顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法2實驗二動物細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察5實驗三細胞器的光鏡切片觀察7實驗四動物細胞培養(yǎng)9實驗五ABO血型鑒定與交叉配血16實驗六血涂片的制作與讀片19實驗七細胞有絲分裂標本的制備與形態(tài)觀察23實驗八蝗蟲精巢減數(shù)分裂壓片標本的制備與觀察.27實驗九人外周血染色體制備30實驗十正常人非顯帶染色體的核型分析32實驗一顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法一、實驗?zāi)康? .學(xué)習(xí)普通臺式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能和使用方法。2 .學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。3 .了解幾種特殊光學(xué)顯微鏡的工作原理及其使用光學(xué)顯微鏡的使用（

2、一）顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法光學(xué)顯微鏡，簡稱光鏡（microscope）,是生物醫(yī)學(xué)研究及臨床工作中常用的儀器，每個學(xué)生都必須熟悉它的結(jié)構(gòu)和性能，掌握其使用方法。1.光學(xué)顯微鏡的主要構(gòu)造顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學(xué)部分（圖1-1）。（1）機械部分鏡座：亦稱鏡腳，是顯微鏡的基座，用以支持整個顯微鏡。鏡柱：是鏡座向上直立的短柱，用以支持其他部分。鏡臂：是鏡柱向上彎曲的部分，適于手握。有些顯微鏡鏡柱與鏡臂之間有傾斜關(guān)節(jié)。鏡筒：連在鏡臂前方的鏡筒部分，一般長度為16cm0有直筒和斜筒兩種，前者鏡筒上下可調(diào)節(jié)，后者鏡筒是固定的調(diào)節(jié)器：是裝在鏡臂上的大小兩種螺旋，轉(zhuǎn)動時可使鏡臺升降或

3、使鏡筒上下移動以調(diào)節(jié)焦距。粗調(diào)節(jié)器（粗螺旋）轉(zhuǎn)動時可使鏡臺或鏡筒在垂直方向以較快速度和較大距離進行上下升降，調(diào)節(jié)物鏡與標本的距離。通常在低倍鏡下，先用粗調(diào)節(jié)器找到物像。細調(diào)節(jié)器（細螺旋）形狀較小，通常在粗調(diào)節(jié)器的下方或外側(cè)，轉(zhuǎn)動時可使鏡臺或鏡筒緩慢地上下移動，以精細調(diào)節(jié)焦距，得到清晰的物像。旋轉(zhuǎn)器（鏡頭轉(zhuǎn)換器）：裝在鏡筒的下端，呈盤狀，下面有34個物鏡孔供裝置不同放載物臺（鏡臺）：用以放玻片樣本，中間有一通光圓孔，稱為鏡臺孔，由此孔可透入集光器傳入的光線。標本移動器：裝于載物臺上，用于前后左右移動玻片標本。移動器上有標尺，可以測定標本大小。（2）照明部分.反光鏡（mirror）:是一個一面平一

4、面凹的雙面鏡，裝在鏡柱基部的前方，可向任意方向轉(zhuǎn)動，其作用是改變光源射出的光線方向，送至聚光鏡中心，再經(jīng)鏡臺孔照明標本。反光鏡的凹面聚光作用較強，通常在光線較弱時使用；在光線強而均勻時，宜用平面鏡。有些顯微鏡采用電光源代替反光鏡，使用時接上電源，在打開電源前，光照亮度旋至最小位置，然后打開電源，旋轉(zhuǎn)亮度旋扭調(diào)節(jié)光照強度至適宜為止。關(guān)閉電源前，應(yīng)先將光照亮度旋至最小位置。聚光器（又名集光器，condenser）：位于載物臺下方的聚光器架上，由聚光鏡和虹彩光闌組成。聚光鏡由一片或數(shù)片透鏡組成，其作用相當于一凸透鏡，起會聚光線的作用，一般可通過裝在鏡柱旁的聚光器調(diào)節(jié)螺旋的轉(zhuǎn)動而上下移動，上升時視野中

5、光亮度增加，下降時光亮度變?nèi)?、虹彩光闌（又名光圈，diaphragm）在聚光鏡下方，由十幾張活動的金屬薄片組成。其外側(cè)伸出一柄，推動此柄可隨意調(diào)節(jié)開孔的大小，以調(diào)節(jié)光量。（3）光學(xué)部分目鏡（ocular）:位于鏡筒上方，常用的有5X,6X,8X,10X,12X,15X,數(shù)字越大，放大倍率越高，可根據(jù)需要挑選使用。一般裝在鏡筒上的是10對鏡。物鏡（objective）:裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，一般有34個物鏡。其中最短的刻有“4乂或"10乂符號的為低倍鏡，較長的刻有“40乂符號的為高倍鏡；最長的刻有“100乂符號的為油鏡。在物鏡上，還有鏡口率（NA）的標志。鏡口率反映該鏡頭分辨力的大小

6、，其數(shù)字越大，表示分辨力越高。物鏡的工作距離是指顯微鏡處于工作狀態(tài)（物像調(diào)節(jié)清楚）時，物鏡的下表面與蓋玻片（蓋玻片的厚度一般為0.17mm）上表面之問的距離。物鏡的放大倍數(shù)愈大，它的工作距離愈小。顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如：物鏡為10X,目鏡為10X,其放大彳數(shù)就為l00。2 .光學(xué)顯微鏡的使用方法（1）低倍鏡的使用方法檢查：用右手握鏡臂，從鏡箱中將顯微鏡取出，左手托鏡座，平穩(wěn)地放到實驗桌上。使用前應(yīng)先檢查一下顯微鏡各部分結(jié)構(gòu)是否完整，如發(fā)現(xiàn)有缺損或性能不良，要立即報告教師，請求處理。準備：將顯微鏡放于自己座位面前實驗桌上稍偏左側(cè)，鏡臺向前鏡筒向后，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器

7、使鏡臺遠離物鏡，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡對準鏡臺孔，這時可聽到轉(zhuǎn)換器邊上固定扣碰上而發(fā)出的聲音，或手上感到一種阻力，說明物鏡的光軸已正對鏡筒的中心。對光：打開光圈，將聚光器上升。雙眼同時張開，以左眼向目鏡內(nèi)觀察（如為雙筒顯微鏡，用雙眼觀察.，下同），調(diào)節(jié)反光鏡的方向，使光線射入鏡筒中，直到求得明亮而均勻的視野為止；或打開電源，調(diào)節(jié)光照亮度旋鈕，直到光亮度最適宜為止。置片和調(diào)整焦距：將玻片標本置于鏡臺上，注意使有蓋玻片的一面朝上，利用標本移動器將玻片夾住，然后將玻片稍加調(diào)節(jié)，使標本對準鏡臺孔。從側(cè)面注視低倍鏡，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺慢慢上升，至物鏡距標本半厘米處為止，再以左眼自目鏡中觀察，左手轉(zhuǎn)動

8、粗調(diào)節(jié)器使鏡臺徐徐下降，直到視野中出現(xiàn)標本的物像為止；再轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)器，使鏡臺微微上下，調(diào)節(jié)距離，使物像清晰。(2)高倍鏡的使用方法依上法先用低倍鏡找到物像后，將欲觀察的標本部分移到視野中央。眼睛從側(cè)面注視物鏡，用手轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使高倍物鏡對準標本(如果操作正確，此時物鏡與標本之間距離正好，不會碰到)。眼睛向目鏡內(nèi)看，同時只需輕輕轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)器使鏡臺微微升降，即得到清晰的物像。(3)油鏡的使用方法同高倍鏡的使用方法在玻片標本上需要觀察的部分加上少許香柏油，然后轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡對準標本。調(diào)節(jié)油鏡至油鏡的前端浸在香柏油內(nèi)，從目鏡觀察，同時轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)器，至視野出現(xiàn)清楚物像為止。油鏡的放大倍數(shù)大，

9、觀察時要用較強的光線。觀察以后，用粗調(diào)節(jié)器使鏡臺下降(鏡筒上升)，用擦鏡紙將鏡頭、玻片標本上的香柏油擦去，可用少許二甲苯，但不能用力擦，以免損壞鏡頭和標本。水分較多的臨時制片，使用油鏡觀察時，應(yīng)事先吸盡水分。3 .使用光學(xué)顯微鏡的注意事項(1)取顯微鏡時必須右手握鏡臂，左手托鏡座，平貼胸前。切勿一手斜提，前后搖擺，以防碰撞和零件跌落。(2)擦拭顯微鏡的光學(xué)玻璃部分，必須用擦鏡紙，切忌用其他硬質(zhì)紙張或布等擦拭，以免造成鏡面劃痕。(3)切忌用水、酒精或其他藥品浸潤鏡臺或鏡頭。一旦沾染應(yīng)立即進行處理，以免污染或腐蝕鏡頭。(4)放置玻片標本時，應(yīng)將有蓋玻片的一面向上，否則會壓壞標本和物鏡。(5)觀察時

10、應(yīng)兩眼同時張開，用左眼觀察，用右眼注視繪圖。左手調(diào)節(jié)粗、細調(diào)節(jié)器，右手調(diào)節(jié)標本移動器和繪圖。實驗完畢后，將顯微鏡擦拭干凈。物鏡不要與鏡臺相對，關(guān)閉光圈，適當下降聚光器，將反光鏡直立，送回原處。實驗二動物細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察一、實驗?zāi)康挠^察幾種細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)二、實驗用品顯微鏡三、實驗內(nèi)容細胞的基本形態(tài)觀察（一）原理細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)事很多細胞的共同點，在分化程度較高的細胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進化過程所形成點。例如：具有收縮機能的肌細胞伸展為細長型；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動機能的神經(jīng)細胞有長短不一點樹枝狀突起；游離點血細胞為圓形/橢圓形或圓餅形。不論細胞的形態(tài)如何，細胞的結(jié)構(gòu)一般分為三

11、大部分：細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。但也有例外，如哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。（二）觀察方法與結(jié)果1 .制備豬脊髓壓片觀察脊髓前角運動神經(jīng)細胞。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。染色為藍紫色的、大的、有多個突起的細胞是脊髓前角運動神經(jīng)細胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個圓形細胞核，內(nèi)有一個核仁。2 .雞血涂片點制備與觀察取一滴雞血液，靠近一端滴在載玻片上，將另一載玻片點一端呈45°角緊貼在血滴點前緣，均勻用力向前推，使血液在載玻片上形成均勻的薄層，晾干，加瑞氏染液23滴，使覆蓋整個血月I,固定0.51min,滴加等量或稍多點新鮮蒸儲水，與染料混勻染色510min,用清水沖

12、去染液，待自然干燥后或用吸水紙吸干，即可進行鏡檢。顯微鏡下可見雞血細胞為橢圓形，有核。白細胞數(shù)量少，為圓形。3.觀察平滑肌分離裝片低倍鏡下觀察平滑肌分離裝片，可見染成紫紅色呈紡錘形點肌細胞，細胞核為橢圓形,位于細胞的中央，著色很深，在細胞質(zhì)中有淡紅色的肌原纖維。油鏡下低倍鏡觀察作業(yè)1 .思考題為什么使用高倍鏡或油鏡必須從低倍鏡到高倍鏡或從低倍鏡到油鏡的順序進行？如果高倍鏡下找不到物象，應(yīng)從哪些方面找原因，如何解決？2 .繪圖截取40避者油鏡100X下雞紅細胞、神經(jīng)細胞、平滑肌細胞的圖。實驗三細胞器的光鏡切片觀察一、實驗?zāi)康挠^察細胞器中光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)實驗內(nèi)容兩種細胞器的光鏡切片高爾基

13、復(fù)合體的觀察脊神經(jīng)節(jié)以硝酸鉆固定，再經(jīng)硝酸銀染液浸染制成永久制片。高爾基復(fù)合體能與硝酸銀作用，并具有還原能力，使硝酸銀呈現(xiàn)棕黑色沉淀顏色反應(yīng)，因而顯示高爾基復(fù)合體的形態(tài)和位置。方法：低倍鏡觀察：尋找圓形或橢圓形的被染成黃色或淡黃色的細胞；轉(zhuǎn)換高倍鏡：中央透亮區(qū)為核所在位置，核周圍棕褐色扭曲呈線狀、顆粒狀結(jié)構(gòu)即為高爾基復(fù)合體。線粒體的觀察原理肝、腎組織細胞富含線粒體，以重銘酸鉀固定，再經(jīng)鐵蘇木精染色，制成永久制片。線粒體有雙層膜結(jié)構(gòu)，蛋白、磷脂含量很高，有大量竣基和磷酸基等陰離子基團，含陽離子的鐵蘇木精易與其結(jié)合，使線粒體顯示蘭色反應(yīng)。方法低倍鏡觀察：可見許多被染成深蘭色的細胞，選擇顏色清晰，密

14、集程度較低的區(qū)域；轉(zhuǎn)換高倍鏡：細胞核為1-2圓形的不著色的區(qū)域（有深蘭色的核仁），核周圍分布有許多深蘭色顆?；驐U狀小體，即線粒體。附：生物學(xué)實驗繪圖方法與要求繪圖時生物學(xué)實驗報告點一種重要形式，其基本要求如下：1 .準備好3H鉛筆、橡皮、刀、尺子及繪圖紙，將繪圖紙放在觀察物的右邊，紙下不要墊書或紙張。2 .繪圖時，特別注意觀察物的形狀、各部分點位置、比例和毗鄰關(guān)系。3 .圖點位置、大小要適宜，圖占報告紙左上方2/3點面積，并考慮注字點位置。4 .觀察清楚后，選擇典型的細胞或者組織，左眼看顯微鏡，右眼配合左眼，先用鉛筆在紙上輕輕描出輪廓，使形態(tài)正確，然后再用清晰的線條繪出，線條粗細要均勻不要重復(fù)

15、。5 .用圓點表示明暗和立體感，點的點大小要均勻，不能涂陰影。6 .圖繪好后，要在圖點右側(cè)注明各部分結(jié)構(gòu)名稱，引線要直而平行，長短適度，各引線不能交叉，各線右端上下對齊，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右寫。7 .每一個圖下面要注明圖的點名稱、放大倍數(shù)。8 .繪圖紙上所有注字（包括姓名、實驗日期、題目等）均用鉛筆書寫，不能用其他筆寫。作業(yè).繪圖截取40><者油鏡100X下高爾基體和線粒體實驗四動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織（或器官）取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng)。使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等過程的生

16、命現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細胞培養(yǎng)便于人們對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如細胞骨架等卜細胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細胞培養(yǎng)是探索和指示細胞生命活動規(guī)律的一種簡便易行的實驗技術(shù)，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離了生物機體后的一些變化。細胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、月中痛學(xué)及病毒學(xué)等I清洗與滅菌一、實驗?zāi)康? .了解細胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的基本操作方法；2 .掌握細胞培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)；3 .學(xué)習(xí)倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細胞的觀察。二、實驗原理清洗與消毒是組織培

17、養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。三、實驗材料、用品材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜（直徑25）:孔徑為0.22仙叫微孔濾膜（直徑90）:孔徑為0.2211m,過濾器（直徑25）。藥

18、品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液（來蘇兒水），0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高鈕酸鉀，NaOH,鹽酸，重銘酸鉀，濃硫酸（工業(yè)），DEPC水體積分數(shù)0.1%的焦炭酸二乙酯。儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。四、實驗步驟(一)清洗1 .新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。2 .使用過的玻璃器皿的清洗使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液過夜。(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗1015次去除殘余酸液，蒸儲水涮洗3次，倒置烘干。(5)

19、包裝(牛皮紙或一般紙)。(6)高壓(15磅20min)或干熱(170C2h)滅菌。貯存?zhèn)溆谩? .膠塞的處理(1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10-20min。自來水清洗10次。再用1%稀鹽酸浸泡30min。(4)自來水清洗10次，蒸儲水涮洗3次。晾干，高壓滅菌。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸儲水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。(二)消毒1 .物理消毒法(1)紫外線消毒用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。(2)干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)

20、，加熱至160C,保溫90120min。用于RNA提取實驗的用品則需180C,保溫58h。(3)濕熱滅菌此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20>SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣510min,以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121C)30min,膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115C)20min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力

21、。停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。(4)濾過除菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直彳90mm、100mm、142mm等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直彳520mm、25mm等)。濾膜孔徑有0.60Nm、0.450.350.22N加0.10仙111等，以0.22小賒菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22小解用

22、布包好，濕熱滅菌后使用。2 .化學(xué)消毒法常用的消毒液有如下幾種：70%(或75%)酒精：超凈臺里常備70%酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或10工作臺面的消毒。(2)0.1%新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0.1%新潔爾滅溶液的容器及紗布。(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。(4)0.5%過氧乙酸：是強效消毒劑，10min即可將芽抱菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入培鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至

23、沸騰為止。將門窗緊閉13do可將空氣中漂浮的微生物殺死。(6)37%甲醛加高鈕酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37%甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高鈕酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。13d后方可達到消毒空氣的目的。3 .煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。五、注意事項1 .清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗1015次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。2 .干熱滅菌

24、時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當溫度超過100c時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100c之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.3 .高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。4 .牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR,秋水仙素,谷氨酰胺，異硫氟酸月瓜，MOPS等)。5 .濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通

25、過濾膜。裝濾膜時位置要準確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。6 .使用化學(xué)消毒法時，配制75%酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性?？諝庀緯r，所有的物品要事先準備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和傷害作用。六、思考題1 .哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。2 .紫外線消毒的適用范圍和目的是什么？II、原代細胞培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康?11 .了解細胞原代培養(yǎng)基本操作方法；2 .掌握細胞培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)；3 .學(xué)習(xí)

26、倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細胞的觀察。二、實驗原理動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將它分散成單個細胞后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。三、實驗用品1、器材解剖剪、解剖鑲、眼科剪（尖頭、彎頭）、眼科鑲（尖頭、彎頭）、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa（15磅）滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細胞計數(shù)器、血細胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、解剖板等。2、試劑磷酸鹽緩沖液（PBS）、無鈣、鎂溶液、細胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%ED

27、TADMEM液3、材料乳鼠四、實驗方法操作步驟方法一：胰酶消化法1 .洗手，用酒精擦手。2 .點燃酒精燈，將所需用品擺放整齊，方便自己操作。3 .取一只乳鼠，浸入75%乙醇中23s,然后取出來，放在滅菌好的培養(yǎng)皿中。4 .取材：取出無菌的手術(shù)器械，如果乳鼠還沒有死亡，用銀子夾具頭部處死乳鼠。用銀子提起腹部皮膚，用解剖剪充分剪開腹腔，將肝臟組織取下來，放入一個滅菌好的青霉素瓶中，用無菌吸管吸取3mlHanks液清洗23次，直至去掉血污為止。5 .消化：將洗凈的組織塊移入干凈的無菌的青霉素瓶中，將剪刀伸入瓶內(nèi)反復(fù)剪切組織塊，直至剪到0.51mm3大小的塊狀為止。加入2ml0.25%胰蛋白酶，輕輕晃

28、動，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，蓋好蓋子，放在37c水浴中消化2030min,注意每間隔5min振搖一次。視組織塊變得疏松，顏色略變白時隨即從水浴中取出，放入超凈臺內(nèi)，用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成細胞團或單個細胞，加入12ml培養(yǎng)液終止胰酶消化，靜止片刻，讓未被消化完的組織自然沉降，然后用吸管將細胞懸液移入無菌青霉素瓶中，蓋好蓋子。6 .離心：將青霉素瓶做好標記，平衡后以1000r/min離心8min。在超凈臺內(nèi)棄上清，加入3ml培養(yǎng)液，吹打混勻后，取1滴去鏡檢，適當調(diào)整細胞密度。7 .細胞培養(yǎng)：取1ml細胞懸液至一干凈的培養(yǎng)皿中，再添加12ml培養(yǎng)液，蓋上蓋子后，輕12輕搖

29、勻，置37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 .觀察：每天對培養(yǎng)的細胞做常規(guī)檢查，觀察的主要內(nèi)容是：污染與否、細胞生長狀態(tài)和pH（培養(yǎng)液顏色變化）等情況。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)闄幟庶S又顯渾濁，表明可能被污染，細胞也就不易貼壁生長而逐漸死亡。如培養(yǎng)液顏色為橘紅色，一般說明細胞生長狀態(tài)良好。接種24h后，可見到許多細胞貼壁（由圓形懸浮狀態(tài)的細胞延展成扁平狀）。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞生長繁殖數(shù)量增加，培養(yǎng)液會逐漸變?yōu)辄S色，這時可進行傳代培養(yǎng)。方法二：1-4步驟同胰酶消化法5 .將洗凈的組織塊移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小塊，然后加入12滴培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。用吸管分次吸取組織漿塊，放入培養(yǎng)瓶壁上

30、散開，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使貼服組織面朝上，加入34ml培養(yǎng)液，加蓋，做標記后，放置一段時間后，待組織小塊略干燥能牢固貼于瓶壁時，再慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（動作一定要輕，減少振動，防止組織塊脫落），使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)。6 .觀察：同胰酶消化法。III.傳代細胞培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康牧私鈧鞔毎膫鞔椒安僮鬟^程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況。二、實驗原理傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1:2或1:2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。這種培養(yǎng)，第一步也是制備細胞懸液，當細胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破壞。所以一般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸鹽）的混合

31、物，做為消化液。細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。三、實驗用品1、器材解剖剪、解剖鑲、眼科剪（尖頭、彎頭）、眼科鑲（尖頭、彎頭）、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa（15磅）滅菌30min備用。止匕外，還有顯微鏡、血細胞計數(shù)器、血細胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記

32、筆、解剖板等。132、試劑磷酸鹽緩沖液（PBS）無鈣、鎂溶液細胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料雞胚細胞四、實驗方法在做傳代細胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細胞是否已長成致密單層，如已長成單層,1.營養(yǎng)液配制：EMEM液犢牛血清雙抗（1萬單位/ml）7.4%NaHCO32.換液：即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。90%10%加至約100單位/m1調(diào)pH至6.87.0在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細胞營養(yǎng)液3 .消化與分裝在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復(fù)上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04%EDTA1ml十o.5

33、%胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細胞為宜，置于室溫，停留12min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層是否出現(xiàn)縫隙（針孔大小的空隙），如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1o然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全部脫落下來為止。此時，可繼續(xù)輕輕地吹打細胞懸液，以使細胞散開。隨之進行分裝。4 .培養(yǎng)分裝好的細胞瓶上，做好標志，注明細胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細胞均勻分布，以免堆積成團。然后置于37c培養(yǎng)。5 .觀察（1）觀察體外培養(yǎng)細胞的幾個問題；細胞培養(yǎng)24h后，即可進

34、行觀察，觀察的重點如下：A.首先要觀察培養(yǎng)細胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細胞是否生長。C.如細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照（2）的描述進行。D.觀察完畢，可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以確定死、活細胞的比例。（2）細胞的生長階段及其形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細胞需逐日進行觀察，注意細胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細胞生長的情況。一般中層培養(yǎng)的細胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將其分為5個時期，但各期間無明顯絕對界限?，F(xiàn)14分別描述如下：A.游離期：當細胞經(jīng)

35、消化分散成單個細胞后，由于細胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以，此時細胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)小時。B.吸附期（貼壁）：由于細胞的附壁持性，細胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間（約7-8h）后，便附著在瓶壁上（此期不同細胞所需時間不同）。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細胞，如圓形、扁形、短菱形。細胞的特點，大多立體感強，細胞內(nèi)顆粒少，透明。C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h,細胞進入繁殖期，加速了細胞生長和分裂。此期包括由幾個細胞形成的細胞島（即由少數(shù)細胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細胞群，常散在地分布在瓶壁上）,到細胞鋪滿整個瓶壁（即所謂形成細胞單層）的過程。此期細胞形態(tài)為多角形

36、（呈現(xiàn)上皮樣細胞的特征）。細胞特點：透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。根據(jù)細胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以干”的多少表示如下：十：細胞占瓶壁有效面積（也就是細胞能生長的瓶壁面積）的25%以內(nèi)有新生細胞。一般要觀察35個視野內(nèi)的細胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。十十：細胞占瓶壁有效面積的25-75%以內(nèi)具新生細胞。十十十：細胞占瓶壁有效面積的7595%具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：細胞占瓶壁95%以上，細胞已長滿或接近長滿單層，細胞致密，透明度好。從十十一十十十十為細胞的對數(shù)增長期（或稱為指數(shù)增長期）0D.維持期：當細胞形成良好單層

37、后，細胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細胞生長的接觸抑制。此時細胞界限逐漸模糊，細胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。E.衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時細胞問可出現(xiàn)空隙，細胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細胞經(jīng)固定染色處理后，可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。五、思考題1.簡述細胞原代與傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項3.細胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么？3.簡述體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征及其生長階段。1

38、5實驗五O血型鑒定與交叉配血一、實驗原理與目的血型就是紅細胞膜上特異抗原的類型。在ABO血型系統(tǒng)中，紅細胞膜上抗原分A和B兩種抗原，而血清抗體分抗A和抗B兩種抗體。A抗原加抗A抗體或B抗原加抗B抗體，則產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。血型鑒定是將受試者的紅細胞加入標準A型血清（含有抗B抗體）與標準B型血清（含有抗A抗體）中，觀察有無凝集現(xiàn)象，從而測知受試者紅細胞膜上有無A或/和B抗原。在ABO血型系統(tǒng)，根據(jù)紅細胞膜上是否含A、B抗原而分為A、B、AB、O四型。（見下表）ABO血型中的抗原和抗體血型紅細胞膜上所含的抗原血清中所含的抗體O無A和B抗A和抗BAA抗BBB抗AABA和B無抗A和抗B交叉配血是將受血者的紅

39、細胞與血清分別同供血者的血清與紅細胞混合，觀察有無凝集現(xiàn)象。輸血時，一般主要考慮供血者的紅細胞不要被受血者的血清所凝集；其次才考慮受血者的紅細胞不被供血者的血清所凝集。前者叫交叉配血試驗的主側(cè)（也叫直接配血），后者叫交叉配血的次側(cè)（也叫間接配血）。只有主側(cè)和次側(cè)均無凝集，稱為“配血相合”，才能進行輸血；如果主側(cè)凝集，稱為“配血不合”或“配血禁忌”，絕對不能輸血；如果主側(cè)不凝集，而次側(cè)凝集，可以認為“基本相合”，但輸血要特別謹慎，不宜過快過多，密切注視有無輸血反應(yīng)。本實驗的目的是學(xué)習(xí)ABO血型鑒定的原理、方法以及交叉配血方法。二、實驗對象學(xué)生三、實驗器材和藥品1 .儀器顯微鏡，離心機。2 .器械

40、采血針，消毒注射器，雙凹玻片，小試管，竹簽，棉球，臘筆。3 .藥品標準A血清，標準B血清，生理鹽水，75%酒精，碘酒。四、實驗步驟和觀察指標16紅細胞血清血清交叉配血示意圖(一)ABO血型鑒定1 .玻片法(1)取雙凹玻片一塊，用干凈紗布輕拭使之潔凈，在玻片兩端用臘筆標明A及B,并分別各滴入A及B標準血清一滴。(2)細胞懸液制備從指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理鹽水的小試管內(nèi)，混勻，即得約5%紅細胞懸液。采血時應(yīng)注意先用75%酒精消毒指尖或耳垂。(3)用滴管吸取紅細胞懸液，分別各滴一滴于玻片兩端的血清上，注意勿使滴管與血清相接觸。(4)竹簽兩頭分別混合，攪勻。(5)1030min后觀察結(jié)果。

41、如有凝集反應(yīng)可見到呈紅色點狀或小片狀凝集塊浮起。先用肉眼看有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨時，則在低倍顯微鏡下觀察，如有凝集反應(yīng)，可見紅細胞聚集成團。(6)判斷血型根據(jù)被試者紅細胞是否被A,B型標準血清所凝集，判斷其血型。2 .試管法(1)取試管2只，分別標明A,B字樣，分別加入相應(yīng)標準血清2滴，各管加入受試者的紅細胞懸液12滴搖勻。(2)將上述二試管用1000轉(zhuǎn)/分離心1min。(3)取出小試管，輕彈底部，如沉淀物呈團塊狀浮起為凝集，呈散在煙霧狀上浮進而恢復(fù)原混懸狀為無凝集。(二)交叉配血1.玻片法17(1)用碘酒，75%酒精棉球消毒皮膚后,用消毒干燥注射器抽取受血者及供血者靜脈血各2ml,各用一

42、滴制備紅細胞懸液，分別標明供血者與受血者。余下血分別注入干凈小試管，也標明供血者與受血者，待其凝固后析出血清備用。(2)左兩凹玻片左側(cè)標上主”(即主側(cè))；右側(cè)標上次”(即次側(cè))。主側(cè)滴入供血者紅細胞懸液一滴和受血者血清一滴；次則滴入受血者紅細胞懸液一滴和供血者血清一滴。分別用竹簽混勻。(3)1530min后，觀察結(jié)果。如兩側(cè)均無凝集現(xiàn)象，可多量輸血；如主側(cè)無凝集而次側(cè)有凝集只可考慮少量輸血；如主側(cè)凝集則不能輸血。2.試管法取二試管，分別注明“主”、“次”字樣，管內(nèi)所加內(nèi)容物同玻片法，混勻后1000rpm離心1min,取出觀察結(jié)果。注意事項1 .所用雙凹玻片的試管實驗前必須清洗干凈，以免出現(xiàn)假凝

43、集現(xiàn)象。2 .A及B標準血清絕對不能相混，所用滴管上貼橡皮膏標明A及B、紅細胞懸液滴管頭不能接觸標準血清液面，竹簽一端去混勻一側(cè)就不能去接觸另一側(cè)。思考題1 .在無標準血清情況下已如某人為A或B型，能否用其血去檢查未知血型？如何作?2 .交叉配血時為何主側(cè)不凝集而次側(cè)凝集時，可以少量輸血？還需注意些什么？18實驗六血涂片的制作與讀片一.涂片(一)血液涂片的制作(1)需載玻片2張，分別稱為玻片1和玻片2(推片)。(2)用玻片1一端接約3mm直徑的血滴，將此玻片1保持水平。(3)取另一邊緣平整的載玻片2(推片)，將其前端放在血滴前，與片1保持300角并稍向后移與血滴接觸，即見血液沿片2(推片)下緣

44、散開，使血液展開并充滿整個推片的寬度。(4)立刻將推片與載玻片呈30。角，邊輕壓推片邊將血液按下圖的箭頭方向推動涂抹，至血液鋪完血膜為止。(5)(6)(8)揮動片1使血膜吹干，用蠟筆將血膜邊緣圈畫備染色。每只動物涂片一張。一張良好的血片，要求厚薄適宜，頭、體、尾分明。置30min1h后較利于觀察紅細胞的形態(tài)。pofAPPROACHINGADHESION注意事項：如標本本身太短，可觀察的部分會受局限，故以在離開載玻片另一端2cm地方涂抹為宜。載玻片、推片的角度越小、血液越?。煌磕ㄋ俣仍铰?、也越薄。在涂抹貧血病人的血液時，將推片稍豎起(不是30°而是35°40。左右)，以較快的

45、速度推比較好，而對紅細胞增高的病人則相反。如用力過猛白細胞容易破損。二.染色血液涂片的染色(1)將待染涂片平放于染色架上(2)用滴管將染液滴于涂片上，覆蓋整張涂片，放置13分鐘19(3)加入等量的磷酸緩沖液或蒸儲水，與染液混勻，可以用滴管從一端吸入，另一端放出，混勻為止，或用嘴來回輕輕吹之，使之混勻，室溫下染色510分鐘(白細胞數(shù)多或骨髓標本時間應(yīng)長一些，如2030min)o(4)染色結(jié)束時，先用蒸儲水或緩沖液洗將涂片上的染液直接沖掉。(5)再將片子用自來水溫和沖洗，至血液膜呈淡紅色。(6)甩干或晾干玻片。(7)封片。血涂片的觀察方法1 .肉眼觀察在觀察染色標本時，首先用肉眼對顏色進行觀察。如

46、果是正常的末梢血液則呈粉紅色，白血病時白細胞高度增加或骨髓瘤的高丫球蛋白血癥等情況下，血涂片會帶有藍色，此時應(yīng)意識到為異常標本。2 .高倍鏡下觀察首先觀察血涂片制備和染色是否良好、細胞分布是否均勻，同時可估計白細胞數(shù)量增減情況。最后對血涂片的體尾交界的區(qū)域進行觀察，選擇細胞分布均勻不重疊、標本不太厚容易觀察的地方進行油鏡觀察。3 .油鏡下觀察邊移動視野邊觀察下列各項：1)染色是否良好：如果血涂片染色確實不好，應(yīng)重新染色。2)觀察紅細胞形態(tài)：(1)有無人為造成的變形，此外有時載玻片上的堿性物質(zhì)的溶出(玻璃效應(yīng))會導(dǎo)致紅細胞呈嚴重的棘形紅細胞。如固定不良(固定液中含有水分時)會導(dǎo)致呈面包圈形紅細胞

47、，從而無法觀察紅細胞的形態(tài)。(2)大小如何，是大細胞還是小細胞，有無紅細胞大小不一。(3)形態(tài)如何，注意有無畸形紅細胞、球形紅細胞、橢圓新紅細胞、靶形紅細胞、口形紅細胞(唇形紅細胞)、中心淡染色紅細胞、棘形紅細胞、膽狀紅細胞、皺縮紅細胞、淚滴狀紅細胞、破碎紅細胞及鐮狀紅細胞等。(4)是否有染色性的變化，有無嗜多色性紅細胞，中心淡染紅細胞。(5)紅細胞內(nèi)有無異常。觀察是否有嗜堿性點彩、豪-喬小體、卡波環(huán)狀體紅細胞、幼紅細胞、帕彭海姆氏小體和瘧原蟲的出現(xiàn)。(6)有關(guān)大小不一，畸形和嗜多色性，可分為輕度土、中度+、高度三個級別。3)觀察白細胞形態(tài)(1)與紅細胞比較，判斷白細胞數(shù)是否正常，是否增加或減

48、少。紅細胞數(shù)/白細胞數(shù)約為500:1。(2)有關(guān)白細胞的種類，要觀察大量的白細胞后才可判斷是否異常，然后計算白細胞的百分率。在日常檢查中，一般只計算100個，但是發(fā)現(xiàn)異?；虬准毎性黾訒r，盡量增加到200個。計算的白細胞數(shù)越多，白細胞百分率的可信度越高。4)觀察血小板形態(tài)(1)通過與紅細胞的比較，判斷血小板數(shù)量是否正常，是增加或減少。正常情況下每1520個紅細胞中有1個血小板。(2)注意大小的變化。20(3)觀察未加抗凝劑而直接從毛細血管采集的標本時，要注意血小板的凝集性(觀察由若干血小板凝集的現(xiàn)象。如果呈散在狀，則懷疑為血小板無力癥)。(4)觀察有無寄生蟲，當白細胞減低或白細胞分類中單核細胞

49、增多時，應(yīng)注意觀察紅細胞內(nèi)有無瘧原蟲。各種典型血細胞的照片(油鏡下)1.血小板2.紅細胞由1M7虹郵t劫碼ffil+22覆色索性紅蛙膽有幅揖是圖書懵圓愁江糊的圉】和里刑紅郎胞213.正常白細胞圖14-25唁險性分對搐核地胞圖12目叫t性敕如跑圖14-的小游巴斑胞實驗結(jié)果1 .數(shù)碼拍照(1)依次在低倍(X10)、高倍(速0)、油鏡(X100)下觀察紅細胞、白細胞以及血小板正常與異常的變化。(2)用數(shù)碼相機拍攝不同倍數(shù)下的細胞照片。(3)輸入電腦，比較分析各組間的差異。紅細胞呈桔紅色，白細胞核紫色，嗜酸顆粒細胞鮮紅色，嗜堿顆粒細胞藍紫色，中性顆粒細胞紫或紫紅色，淋巴細胞及單核細胞漿藍灰色，血小板紫

50、色。2 .注意事項：1 .染色涂片水沖洗后，應(yīng)在空氣中自然干燥或風干，不可用火烤干。2 .染液量要充足，勿使染液蒸發(fā)干燥。3 .細胞染色過淺或過深，待標本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色數(shù)秒或數(shù)分鐘4 .保存過久的細胞涂片，細胞染色會退色，可重新染色。5 .新鮮涂片應(yīng)立即染色。作業(yè)22繪圖：紅細胞及各種白細胞實驗七細胞有絲分裂標本的制備與形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康耐ㄟ^標本制備和觀察了解生物體細胞的無絲分裂、有絲分裂形態(tài)特征及生殖細胞的減數(shù)分裂過程。二、實驗用品1、材料和標本洋蔥根尖壓片。2、器材和儀器顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科銀子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。3、試劑70%乙醇、改良

51、堿性品紅染液。三、實驗內(nèi)容細胞分裂對生物的個體發(fā)育和生存，對種族綿延有著十分重要的意義，高等生物體內(nèi)細胞的分裂方式有三種：無絲分裂、有絲分裂和減數(shù)分裂。一、動物細胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片（一）原理無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克（Remak）于1841年最早在雞胚血細胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因為此過程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂（Ami-tosis）其后無絲分裂又在各種動植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，尤其在分裂旺盛的細胞中更多見，但遺傳物質(zhì)平均分配否？及其分裂的機制尚不十分清楚。蛙紅細胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。（二）觀察與結(jié)果在高倍鏡下，可見到處于不同階段分

52、裂過程中的蛙紅細胞，核仁先行分裂，向核的兩端移動，細胞核伸長呈桿狀；進而，在核的中部從一面或兩面向內(nèi)凹陷，使核成腎形或啞鈴形改變；最后，從細胞中部直接收縮成兩個相似的子細胞；子細胞較成熟的紅細胞小。二、細胞有絲分裂的觀察一馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖壓片（一）原理細胞有絲分裂（Mitosis）的現(xiàn)象是分別由弗勒明（Flemming,1882）在動物細胞和施特拉斯布格（Strasburger;1880）在植物細胞中發(fā)現(xiàn)。有絲分裂過程包括一系列復(fù)雜的核變化，染包體和紡錘體的出現(xiàn)，以及它們平均分配到每個子細胞的過程。馬蛔蟲受精卵細胞中只有6條染色體，而洋蔥體細胞的染色體為16條，因為它們都具有染色體數(shù)目

53、少的特點，所以便于觀察和分析。（二）觀察1 .動物細胞有絲分裂的觀察一一馬蛔蟲子宮切片取馬蛔蟲的子宮切片標本，先在低倍鏡下觀察，可見馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多橢圓形的受精卵細胞，它們均處在不同的細胞時相。每個卵細胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細胞之間的腔，叫卵殼腔。細胞膜的外面或卵殼的內(nèi)面可見有極體附著。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分23裂不同時期的細胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細觀察。馬蛔蟲受精卵的有絲分裂間期(Interphase)細胞質(zhì)內(nèi)有兩個近圓形的細胞核，一為雌原核，另一為雄原核。兩個原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細胞核附近可見中心粒存在。分裂期(Mitosis)

54、前期(Prophase)t、雄原核相互趨近，染色質(zhì)逐漸濃縮變粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色體相互混合，兩個中心粒分別向細胞兩極移動，紡錘體開始形成。中期(Metaphase跺色體聚集排列在細胞的中央形成赤道板，由于細胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細胞中央，兩極各有一個中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時的染色體已縱裂為二，但尚未分離。24洋蔥根尖細胞有絲分裂后期（Anaphase期錘絲變短，縱裂后的染色體被分離為兩組，分別移向細胞兩極，細胞膜開始凹陷。末期（Telophase修向兩極的染色體

55、恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細胞膜橫縊，兩個子細胞形成。2 .植物細胞有絲分裂的觀察一一洋蔥根尖切片將洋蔥根尖切片標本先在低倍鏡下觀察，尋找生長區(qū)，這部分的細胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細胞形狀呈方形。換高倍鏡仔細觀察不同分裂時期的細胞形態(tài)特征.與動物細胞有絲分裂特征比較，找出植物細胞有絲分裂的特點和兩者的區(qū)別。3 .制備蠶豆根尖臨時壓片水解：取出根尖放在1NHCl中60c水解8min,蒸儲水水洗3次。染色：把處理好的根尖放在載玻片上，切取乳白色的分生區(qū)，用銀子輕輕搗碎，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色510min后，蓋上蓋玻片。壓片：在蓋玻片上面鋪上吸水紙，固定好蓋玻片，用拇指垂直壓片，再用橡皮輕敲擊，使材料壓成均勻的薄層。鏡檢觀察有絲分裂的各期細胞。啊期細胞核25實驗報告繪圖：細胞間期及分裂期圖片26實驗八蝗蟲精巢減數(shù)分裂壓片標本的制備與觀察一、實驗?zāi)康耐ㄟ^標本制備和觀察了解生殖細胞的減數(shù)分裂過程。二、實驗用品1、材料和標本蝗蟲精巢。2、器材和儀器顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科銀子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。三、實驗試劑70%乙醇、改良堿性品紅染液。四、實驗內(nèi)容（一）原理減數(shù)分裂（Mei