血紅蛋白的提取和分離-學(xué)案

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上§5.3血紅蛋白的提取和分離導(dǎo)學(xué)案 班級(jí)：高二（ ）班 姓名： 【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.概述凝膠色譜法、電泳法分離大分子的基本原理。2.知道緩沖溶液的作用。3.嘗試對(duì)血液中血紅蛋白進(jìn)行提取和分離,體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基礎(chǔ)過程和方法。4.掌握對(duì)樣品的預(yù)處理、色譜柱制作及裝填等操作,進(jìn)行樣品的加入和洗脫并最終分離出血紅蛋白?！咀灾鲗W(xué)習(xí)】一、基礎(chǔ)知識(shí)1.蛋白質(zhì)的分離依據(jù):蛋白質(zhì)特性的差異,如分子的形狀和_、所帶_的性質(zhì)和多少、溶解度、_和對(duì)其他分子的親和力等。2.凝膠色譜法:(1)概念:也稱做_,是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。(2)凝膠的特點(diǎn)形態(tài):微小的_組成

2、:大多數(shù)由_構(gòu)成結(jié)構(gòu):內(nèi)部有許多_(3)常用凝膠:_和瓊脂糖。(4)分離原理。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程_,移動(dòng)速度_,通過凝膠的時(shí)間_。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠_移動(dòng),路程_,移動(dòng)速度_,通過凝膠的時(shí)間_。 3.緩沖溶液:(1)作用:在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能夠抵制_對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變。(2)配制:通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以制得_的緩沖液。(3)意義:為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程,保持_與體內(nèi)環(huán)境中的pH基本一致。4.電泳:(1)概念:帶電粒子在_的作用下發(fā)生_的過程。(

3、2)原理。帶電粒子:許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_的基團(tuán),在一定的pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上_。遷移動(dòng)力與方向:在電場(chǎng)的作用下,帶電分子會(huì)向著與其_的電極移動(dòng)。分離依據(jù):電泳利用了待分離樣品中各種分子_以及分子本身的_、_的不同,使帶電分子產(chǎn)生_,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。(3)常用的電泳方法:_電泳和_電泳。 二、實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:(1)紅細(xì)胞的洗滌。目的:去除_。方法:_。標(biāo)準(zhǔn):直至上清液不再呈現(xiàn)_。(2)血紅蛋白的釋放。 (3)分離血紅蛋白溶液。方法:混合液 分層。分層結(jié)果(自上而下):第1層:無色透明的_。第2層:脂溶性物質(zhì)的_白色薄層固體。 第3層:_的水溶液_透明

4、液體。第4層:其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。結(jié)果處理:將試管中的液體用_過濾,除去_沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的_液體。2.透析粗分離:(1)過程:取1 mL的_溶液裝入_中,將其放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的_中(pH為7.0),透析_ h。(2)原理:透析袋能使_自由進(jìn)出,而將_保留在袋內(nèi)。(3)目的:去除樣品中_的雜質(zhì)。3.凝膠色譜操作純化:(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填:凝膠用_充分溶脹后,配成凝膠懸浮液,_緩慢倒入凝膠色譜柱內(nèi)(3)樣品的加入 加樣前：打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面_，關(guān)閉出口加樣：用吸管小心地將1

5、 mL透析后的樣品加到色譜柱的_，注意不要破壞凝膠面加樣后：打開下端出口，使樣品滲入_內(nèi)(4)洗脫:_下端出口,加入磷酸緩沖液,連接_,_下端出口,進(jìn)行洗脫4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳純度鑒定:判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,需要進(jìn)行_的鑒定。鑒定方法中,使用最多的是_。三、操作提示1.紅細(xì)胞的洗滌:_、離心速度與_十分重要。洗滌次數(shù)過少,無法除去_蛋白;離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀,達(dá)不到分離的效果。2.色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在_中膨脹,可以將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱,加速膨脹。3.凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時(shí),不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白

6、質(zhì)的_,降低_。4.蛋白質(zhì)的分離:如果紅色區(qū)帶_,說明色譜柱制作成功。【預(yù)習(xí)小測(cè)】1.相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì),無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,移動(dòng)速度較慢。( )2.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)利用了蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小和形狀的不同。( )3.電泳法分離樣品只取決于蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小。( )4.紅細(xì)胞的洗滌是為了徹底除去雜蛋白,應(yīng)快速高速離心。( )5.豬成熟紅細(xì)胞中缺少細(xì)胞器和細(xì)胞核,提純時(shí)雜蛋白較少。( )6.樣品處理和粗分離的目的都是除去相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。( )7.若紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng),說明色譜柱制作成功。( )8.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是蛋白質(zhì)分子相對(duì)分子質(zhì)量

7、和帶電性質(zhì)的差異。( )【合作探究】主題1蛋白質(zhì)的分離原理及方法1.凝膠色譜法： 結(jié)合上圖，說出凝膠色譜法分離不同物質(zhì)的依據(jù)并填表比較蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)情況。(1)依據(jù)：_。(2)蛋白質(zhì)在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況：相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)別相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小運(yùn)動(dòng)方式垂直向_運(yùn)動(dòng)無規(guī)則的_運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度_較慢運(yùn)動(dòng)路程_洗脫次序_從凝膠柱中洗脫出來_從凝膠柱中洗脫出來2.電泳：(1)從電荷方面分析適合電泳法分離的各種分子應(yīng)具備的條件是：各種分子應(yīng)帶有不同_和不同量的_。(2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)是否依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異？為什么？提示：_。因?yàn)镾DS能與蛋白質(zhì)結(jié)合，它所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)分

8、子原有的_，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的_，使電泳遷移率完全由蛋白質(zhì)分子的_決定。主題2血紅蛋白的提取與分離實(shí)驗(yàn)操作1.實(shí)驗(yàn)操作：(1)哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞適用于進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的原因有哪些？提示：哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞內(nèi)沒有_和各種復(fù)雜的_，排除了其他物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。(2)請(qǐng)分析洗滌紅細(xì)胞的目的，總結(jié)判斷紅細(xì)胞洗滌干凈的依據(jù)。目的：_。依據(jù)：_。(3)探究血紅蛋白釋放過程中蒸餾水和甲苯的作用。蒸餾水的作用：使紅細(xì)胞_，釋放細(xì)胞內(nèi)_；甲苯的作用溶解_，有助于血紅蛋白的釋放。(4)寫出分離血紅蛋白混合液的結(jié)果?；?/p>

9、合液分為4層 第1層(最上層)：_第2層(中上層)：_第3層(中下層)：_第4層(最下層)：_(5)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進(jìn)行透析，透析的目的是什么？提示：血紅蛋白是大分子物質(zhì)，不能透過透析袋，這樣可以去除_的雜質(zhì)。2.凝膠色譜操作：(1)在制作凝膠色譜柱時(shí)，若凝膠色譜柱的高度不足，則_。(2)試從凝膠色譜的分離原理分析凝膠若裝填得不夠緊密、均勻，則會(huì)：在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂_，影響分離的效果。(3)氣泡對(duì)蛋白質(zhì)分離產(chǎn)生的影響是_。(4)推測(cè)樣品洗脫時(shí)，紅色區(qū)帶可能會(huì)出現(xiàn)哪些情況？提示：如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶_；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效