溫度對蟾蜍冬眠的影響

1、溫度對蟾蜍冬眠的影響 實驗目的：通過改變溫度，通過對蟾蜍體重和血糖的測量，做到進一步對蟾蜍的生活習性的了解。實驗原理：蟾蜍冬眠期間是不進食的，通過消耗體內的脂肪來提供必要的生命活動能量。蟾蜍在進入冬眠后它的脂肪消耗會大大減少。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產生過氧化氫：在色原性氧受體(如聯(lián)大茴香胺，4氨基安替比林偶聯(lián)酚)的存在下，過氧化物酶催化過氧化氫，氧化色素原，生成有色化合物。實驗儀器：電冰箱，電子天平，離心機，PE手套，移液槍，容量瓶，燒杯，棕色廣口瓶，滴管，烤箱。實驗試劑：10.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH70)：溶解無水磷酸氫二鈉8.67g及無水磷酸二氫鉀53g于800

2、ml蒸餾水中，用lmol/L氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH值至7o，然后用蒸餾水稀釋至1L；2酶試劑：取葡萄糖氧化酶1200U，過氧化物酶1200U，4-氨基安替比林l0mg，疊氟鈉100mg，加上述磷酸鹽緩沖液至80ml左右，調節(jié)pH值至70，加磷酸鹽緩沖液至100ml，置冰箱保存，至少可穩(wěn)定3個月；3酚溶液；重蒸餾酚100mg溶于l00ml蒸餾水中，貯存于棕色瓶中；4酶酚混合試劑：酶試劑及酚溶液等量混合，在冰箱內可以存放1個月；5葡萄糖標準貯存液(100mmolL)：稱取無水葡萄糖(預先置80'C烤箱內于燥恒重，移置于干燥器內保存)1802g，以12mmol兒苯甲酸溶液溶解并移入100ml

3、容量瓶內，再以12 mmolL苯甲酸溶液稀釋至l00ml刻度處，放置至少2h后方可應用； 6葡萄糖標準應用液(5mmol/L)：吸取葡萄糖標準貯存液5ml，于l00ml容量瓶中，用l2 mmol兒苯甲酸溶液稀釋至刻度，混勻。 7蟾蜍血液820只蟾蜍做實驗動物。試驗方法：將20只蟾蜍分為A、B兩組，每組10只蟾蜍。A組用網(wǎng)格紙盒A,B組用網(wǎng)格紙盒B進行試驗。將A組分別標記為A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10。將B組分別標記為B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10。然后將A組與B組每一只蟾蜍分別稱重記錄數(shù)據(jù)填入表一。將B組蟾蜍分別進行采血，做血糖含量

4、的測定。將記錄的數(shù)據(jù)填進表二。采血的方法：（1）蟾蜍的抓取與固定 抓取方法：直接用左手將蟾蜍背部緊貼手掌，以中指，無名指，小指壓住其左腹側和后肢，拇指和食指分別壓在左，右前肢，以右手進行操作。 在抓取蟾蜍時，不要擠壓其兩側耳部突出的毒腺，以免毒液濺入操作者眼中 固定方法：可破壞其腦脊髓或麻醉后用大頭針固定在蛙木板上，可依實驗需要采取俯臥位或仰臥位。（2） 然后將蟾蜍用注射器從蟾蜍的腹壁靜脈處抽取0.1ml的血液后，置離心機，4，3000r/min離心，10min。取上清液0.02ml盛放在測定管中(16mm×100mm)，加入血清0.02ml,于測定管當中，葡萄糖標準應用液加入標準管

5、里0.02ml，設置對照管，加蒸餾水0.02ml。再給每管加3.0ml的酶酚混合試劑。（3） 混勻，置37'C水浴中，保溫15min，用分光光度計，波長505nm，比色杯光徑1.0cm，以空白管調零，分別讀取標準管及測定管吸光度。（4） 利用公式計算注意事項： 1葡萄糖氧化酶對-D葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%為型，64為型。葡萄糖的完全氧化需要型到型的變旋反應國外某些商品葡萄糖氧化酶試劑盒含有葡萄糖變旋酶，可加速這一反應，但在終點法中，延長孵育時間可達到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標準液主要是型，故須放置2h以上(最好過夜)，待變旋平衡后方可應用。 2過氧比物酶

6、的特異性要比葡萄糖氧化酶的特異性低得多，一些還原性物質如尿酸、抗壞血酸、膽紅質和谷胱甘肽等，可與色原性物質競爭過氧化氫，從而消耗反應過程中所產生的過氧化氫，產生競爭性抑制，使測定結果偏低。然而，在本法的測定條件下，溶血標本血紅蛋白濃度達l0gL，黃疽標本膽紅質濃度達342molL，均不影響測定結果氟化鈉濃度達3gL不干擾測定結果。標本中含尿素濃度達46.7mmolL(280mgdl)，尿酸濃度達2.95mmolL(50mgdl)，肌酐濃度達4.42mmolL(50mgdl)，半胱氨酸濃度達50mgdl，甘油三酯濃度達500mgdl，對測定結果均無顯著影響。3葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因為尿液中尿酸等干擾物質濃度過高，干擾過氧化物酶反應，造成結果假性偏低。 4.方法學評價：GOD法線性范圍至少可達19mmolL;回收率94105%；變異系數(shù)批內為072.0；批間為2%左右；日間為23。準確度與精密度都能達到臨床要求，操作簡便，適用于常規(guī)檢驗。5測定標本以草酸鉀氟化鈉為抗凝劑的血漿較好。取草酸鉀6g，氟化鈉4g，加水溶解至l00ml。吸取01ml到試管內，在80以下烤干使用，可使23ml血液在34天內不凝固并抑制糖分解。表一：溫度時間蟾蜍體