第十三章工業(yè)微生物菌種復(fù)壯和保藏

1、第十三章第十三章 工業(yè)微生物菌種復(fù)壯和保藏工業(yè)微生物菌種復(fù)壯和保藏 性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。 影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素： a）變異；）變異； b）污染；）污染； c）死亡。）死亡。第一節(jié)第一節(jié) 菌種的退化與復(fù)壯菌種的退化與復(fù)壯 菌種退化，菌種退化，主要指生產(chǎn)菌種的或選育過程篩選出來主要指生產(chǎn)菌種的或選育過程篩選出來的較優(yōu)良的菌株，由于進行移接傳代或保藏之后，群體的較優(yōu)良的菌株，由于進行移接傳代或保藏之后，群體中某些生理特性和形態(tài)特征逐漸減

2、退或完全喪失的現(xiàn)象。中某些生理特性和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。 菌種退化的才集中表現(xiàn)：菌種退化的才集中表現(xiàn)：代謝產(chǎn)物合成能力下降；產(chǎn)代謝產(chǎn)物合成能力下降；產(chǎn)量低、發(fā)酵力和糖化力降低，孢子數(shù)量減少，菌落變小，量低、發(fā)酵力和糖化力降低，孢子數(shù)量減少，菌落變小，生長速度減慢等。生長速度減慢等。一、菌種的退化原因一、菌種的退化原因（一）基因突變（一）基因突變1. 基因突變導(dǎo)致菌種退化基因突變導(dǎo)致菌種退化（1）表型延遲現(xiàn)象；）表型延遲現(xiàn)象；（2）雙核或多核孢子分離；）雙核或多核孢子分離；（3）非正倍體或部分雙倍體分離、）非正倍體或部分雙倍體分離、純菌種純菌種自發(fā)突變自發(fā)突變不純菌種不純菌種突變個

3、體突變個體傳代增殖傳代增殖原始個體原始個體衰退衰退菌種菌種2. 質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種退化質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種退化 細(xì)胞中控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)細(xì)胞中控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)和質(zhì)粒復(fù)制不一致，經(jīng)過多代繁殖后，某些細(xì)胞中將出現(xiàn)不具有制不一致，經(jīng)過多代繁殖后，某些細(xì)胞中將出現(xiàn)不具有這一類對產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這些細(xì)胞出現(xiàn)的比例這一類對產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這些細(xì)胞出現(xiàn)的比例越來越大，以致產(chǎn)量下降，菌種退化。越來越大，以致產(chǎn)量下降，菌種退化。（二）連續(xù)移代（二）連續(xù)移代 菌種移接代數(shù)越多，發(fā)生突變的概率就越高。菌種移接代數(shù)越多，發(fā)生突變的概率就越高。（三）培養(yǎng)和保藏條件的影響（三）培養(yǎng)和

4、保藏條件的影響 不良的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基組成、不良的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基組成、pH值、通氣等和值、通氣等和保藏條件如營養(yǎng)、培養(yǎng)基含水量，溫度、氧氣等，不僅保藏條件如營養(yǎng)、培養(yǎng)基含水量，溫度、氧氣等，不僅會誘導(dǎo)低產(chǎn)基因型菌株的出現(xiàn)，而且會造成低產(chǎn)基因和會誘導(dǎo)低產(chǎn)基因型菌株的出現(xiàn)，而且會造成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量比發(fā)生變化。高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量比發(fā)生變化。 要采用減少傳代、經(jīng)常純化、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條要采用減少傳代、經(jīng)常純化、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件，用單細(xì)胞移植傳代以及科學(xué)的保藏方法等措施，件，用單細(xì)胞移植傳代以及科學(xué)的保藏方法等措施，不但可以使菌種保持優(yōu)良的生產(chǎn)能力，而且還能使不但可以使菌種保持優(yōu)良

5、的生產(chǎn)能力，而且還能使已退化的菌種得到恢復(fù)提高。已退化的菌種得到恢復(fù)提高。二、菌種退化的防止二、菌種退化的防止1. 盡量減少傳代盡量減少傳代2. 菌種經(jīng)常純化菌種經(jīng)常純化（1）注重菌落的純化；）注重菌落的純化；（2）單細(xì)胞或單孢子的純化；）單細(xì)胞或單孢子的純化； 實際工作中，要注意觀察和歸納，每次移接時，要實際工作中，要注意觀察和歸納，每次移接時，要有意識地挑選這種菌落類型進行傳代，就可以較長時期有意識地挑選這種菌落類型進行傳代，就可以較長時期地保持優(yōu)良的性狀。地保持優(yōu)良的性狀。3. 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 究竟什么樣的培養(yǎng)基能保持菌種的優(yōu)良特性，應(yīng)進究竟什么樣的培養(yǎng)基能保持菌種

6、的優(yōu)良特性，應(yīng)進行專門的實驗研究。行專門的實驗研究。4. 用單細(xì)胞移植傳代用單細(xì)胞移植傳代 對以霉菌和放線菌，由于菌絲可能是多核的，所以對以霉菌和放線菌，由于菌絲可能是多核的，所以盡可能用單核的孢子移接，如采用棉花團沾取孢子接種。盡可能用單核的孢子移接，如采用棉花團沾取孢子接種。5. 采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法（1）良好的保藏培養(yǎng)基；）良好的保藏培養(yǎng)基；（2）良好的保藏的溫度條件。）良好的保藏的溫度條件。（一）菌種復(fù)壯的原理（一）菌種復(fù)壯的原理（1）狹義的復(fù)壯：狹義的復(fù)壯：從衰退的菌種群體中把少數(shù)從衰退的菌種群體中把少數(shù)正常個正常個體體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種

7、。再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。（2）廣義的復(fù)壯：廣義的復(fù)壯：有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護工作中不斷篩選變的特性，在日常的菌種維護工作中不斷篩選“正變正變”個體個體。三、菌種的復(fù)壯及其方法三、菌種的復(fù)壯及其方法（二）菌種復(fù)壯的主要方法（二）菌種復(fù)壯的主要方法1. 純種分離純種分離（1 1）菌落純：）菌落純：是只要求達到菌落純化的水平，通過稀是只要求達到菌落純化的水平，通過稀釋平板法、劃線法、表面涂血法等常規(guī)操作法，釋平板法、劃線法、表面涂血法等常規(guī)操作法，該方法較為粗放，適用于菌退化不太嚴(yán)重的情況。該方法較為粗放，適用于菌退

8、化不太嚴(yán)重的情況。（2 2）細(xì)胞純：）細(xì)胞純：采用單胞分離法，也可以二者結(jié)合，先采用單胞分離法，也可以二者結(jié)合，先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進一步純化。法進一步純化。 通過物理、化學(xué)的方法處理菌體通過物理、化學(xué)的方法處理菌體( (或孢子或孢子) )，使大，使大部分死亡部分死亡(80%(80%以上以上) )，存活的菌多為生長健壯者，可，存活的菌多為生長健壯者，可從中選出優(yōu)良菌種來。從中選出優(yōu)良菌種來。2. 淘汰法淘汰法3. 宿主體內(nèi)復(fù)壯法宿主體內(nèi)復(fù)壯法 對于寄生性微生物如蘇云金桿菌、白僵菌、多角體對于寄生性微生物如蘇云金桿菌、白僵菌、多

9、角體病毒等，由于長期使用，其毒力會下降，導(dǎo)致殺蟲效率病毒等，由于長期使用，其毒力會下降，導(dǎo)致殺蟲效率降低待衰退現(xiàn)象。這時可以用菌種卻感染菜青蟲幼蟲等，降低待衰退現(xiàn)象。這時可以用菌種卻感染菜青蟲幼蟲等，然后從致死的蟲體上重新分離，經(jīng)過幾次重復(fù)感染與分然后從致死的蟲體上重新分離，經(jīng)過幾次重復(fù)感染與分離，就可以逐步恢復(fù)和提高毒力。離，就可以逐步恢復(fù)和提高毒力。第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的保藏工業(yè)微生物菌種的保藏 工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。所不同。 工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力

10、和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對不產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對不變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。 一、菌種保藏一、菌種保藏目的：目的：在一定時間內(nèi)使菌種在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂不死、不變、不亂，以供，以供研研究、生產(chǎn)、交換究、生產(chǎn)、交換之用。之用?；驹瓌t：基本原則：1 1、挑選典型菌種的、挑選典型菌種的優(yōu)良純種優(yōu)良純種 2 2、盡量使用、盡量使用分生孢子、芽孢分生孢子、芽孢等休眠體等休眠體 3 3、創(chuàng)造有利于休眠的保藏環(huán)境（如、創(chuàng)造有利于休眠的保藏環(huán)境（如干燥、干燥、低溫、缺營養(yǎng)、缺氧

11、低溫、缺營養(yǎng)、缺氧） 4 4、盡可能多的采用、盡可能多的采用不同的手段不同的手段保藏一些比保藏一些比較重要的微生物菌株較重要的微生物菌株1、斜面保藏法、斜面保藏法 簡單冷凍（低溫簡單冷凍（低溫40C冰冰箱），保藏箱），保藏3-6個月，優(yōu)點個月，優(yōu)點是簡單方便，缺點是保藏時是簡單方便，缺點是保藏時間不長，此法細(xì)菌保存采用間不長，此法細(xì)菌保存采用的較多。的較多。 2、石蠟保藏：、石蠟保藏： 利用缺氧、冷卻。（細(xì)利用缺氧、冷卻。（細(xì)菌、無孢子的絲狀菌，如菌、無孢子的絲狀菌，如920產(chǎn)生菌）石蠟使斜面與產(chǎn)生菌）石蠟使斜面與空氣隔絕，造成缺氧環(huán)境?？諝飧艚^，造成缺氧環(huán)境。保藏期：一年左右。（視菌保藏期：

12、一年左右。（視菌種）注意：石蠟層太高，過種）注意：石蠟層太高，過于缺氧。菌種不能利用石蠟于缺氧。菌種不能利用石蠟油作碳源。油作碳源。3、干燥保藏法、干燥保藏法（1）砂土管保藏法）砂土管保藏法 常采用的保藏方法之一，創(chuàng)造和大自然一樣的環(huán)境，常采用的保藏方法之一，創(chuàng)造和大自然一樣的環(huán)境，在在低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)條件低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)條件下保藏。主要用于保下保藏。主要用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。（2） 濾紙條保藏法濾紙條保藏法 將菌體細(xì)胞或孢子吸附在濕的無菌濾紙上，再干燥后將菌體細(xì)胞或孢子吸附在濕的無菌濾紙上，再干燥后置于低溫保藏。適合

13、霉菌、酵母和細(xì)菌的保藏。置于低溫保藏。適合霉菌、酵母和細(xì)菌的保藏。3. 無水硅膠保藏法無水硅膠保藏法4. 麩皮保藏法麩皮保藏法 以無水硅膠為載體的菌種干燥保藏法，適合霉菌和酵以無水硅膠為載體的菌種干燥保藏法，適合霉菌和酵母細(xì)胞的保藏。母細(xì)胞的保藏。 以麩皮為載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條以麩皮為載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存，該法適合產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌的保藏。件下保存，該法適合產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌的保藏。（四）冷凍干燥：（四）冷凍干燥： （1） 原理原理 在較低的溫度下（在較低的溫度下（-15），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使

14、水分升華。細(xì)胞并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。細(xì)胞損傷少，成活率高，保藏期損傷少，成活率高，保藏期10-30年年 是目前常用的是目前常用的 較較理想的一種方法。理想的一種方法。（2）步驟）步驟 滅菌好的保護劑（脫脂牛奶、血清）洗下成熟斜滅菌好的保護劑（脫脂牛奶、血清）洗下成熟斜面孢子或菌體，制菌懸液，裝入安瓿瓶中，塞上棉花，面孢子或菌體，制菌懸液，裝入安瓿瓶中，塞上棉花，冷凍抽干冷凍抽干封口封口 火花真空檢測儀檢查真空度（火花真空檢測儀檢查真空度（ 4 冰箱保藏（干燥器中）。冰箱保藏（干燥器中）。 （五）真空干燥法（五）真空干燥法 菌種不采用冷凍干燥，而在是常溫下真空干燥，適菌種不采

15、用冷凍干燥，而在是常溫下真空干燥，適用于細(xì)菌、放線菌、酵母和噬菌體的保藏，不適合絲狀用于細(xì)菌、放線菌、酵母和噬菌體的保藏，不適合絲狀真菌的保藏。真菌的保藏。（六）液氮保藏法：（六）液氮保藏法： 將需保藏的孢子或菌體懸浮于將需保藏的孢子或菌體懸浮于10（v/v）的甘油）的甘油和和10% 的二甲亞砜保護劑，并放入安瓿管中，火焰封的二甲亞砜保護劑，并放入安瓿管中，火焰封口后將安瓿管以口后將安瓿管以10C /分速度凍結(jié)，慢慢凍結(jié)到分速度凍結(jié)，慢慢凍結(jié)到350C ，放入液氮冰箱（放入液氮冰箱（-1500C -1960C）。）。 此法適用于各類微生物菌種的保藏，尤其是一些此法適用于各類微生物菌種的保藏，尤

16、其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，而采用不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，而采用此法。此法。 優(yōu)點：優(yōu)點：存活率高，穩(wěn)定性強，是長期保藏菌種的最存活率高，穩(wěn)定性強，是長期保藏菌種的最好方法。但要具有液氮和超低溫的冷凍條件，不易推好方法。但要具有液氮和超低溫的冷凍條件，不易推廣。國外已普遍采用，國內(nèi)也有部分單位采用。廣。國外已普遍采用，國內(nèi)也有部分單位采用。 （七）液相保藏法（七）液相保藏法 蒸餾水保藏法蒸餾水保藏法 磷酸鹽緩沖液保藏法磷酸鹽緩沖液保藏法 食鹽溶液保藏法食鹽溶液保藏法二、菌種保藏注意事項二、菌種保藏注意事項 保藏的菌種要用良好的培養(yǎng)基；保藏的菌種要用良好的培養(yǎng)基；在各種保藏方法操作中，要嚴(yán)格的無菌操作；在各種保藏方法操作中，要嚴(yán)格的無菌操作；要注意保藏菌種的制備質(zhì)量；要注意保藏菌種的制備質(zhì)量；要為菌種創(chuàng)造最適宜的保藏條件；要為菌種創(chuàng)造最適宜的保藏條件；嚴(yán)格控制傳代次數(shù)，嚴(yán)格控制傳代次數(shù)