液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱

1、液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮n溶解度 - 選擇流動(dòng)相的條件n分子量 - 在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用n樣品的基質(zhì) - 考慮如何前處理n在基質(zhì)中樣品的含量 n檢測(cè)特性 - 有否紫外吸收? 熒光?n找出樣品中不同組份之間的差異n摸索條件的重要線索極性問題液相色譜的分離機(jī)理n 正相n 反相n 體積排除n 離子交換n 其他n不同的分離模式是不同的機(jī)理吸附色譜的分離機(jī)理 隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小 在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短 吸附色譜概述n分離基于樣品的極性差異。n洗脫次序 一般為正相，即：極性低的先被洗脫n常用的流動(dòng)相n非極性有機(jī)溶劑，如己烷n乙酸等為添加劑n常用固定

2、相n硅膠、氧化鋁等。分配色譜的分離機(jī)理分配色譜概述n反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離n洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫n常用的流動(dòng)相：n有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水n應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法n常用固定相：n碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)n反相色譜固定相多為鍵合相?鍵合相色譜柱n以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。n優(yōu)點(diǎn)n固定相穩(wěn)定，不易流失n應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑n消除硅羥基的不良影響n缺點(diǎn)npH值不能小于3n同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同體積排除色譜的分離機(jī)理凝膠色譜概述n 凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）n 分離基于分子

3、在溶液中的體積大小n 洗脫次序：大分子先被洗脫n 流動(dòng)相不參與分離，只起溶劑作用n 分離效率低n 色譜行為容易預(yù)測(cè)GPC的校正 分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系n從色譜方法上分n正相 / 反相n離子交換n分子體積排除n親合n從柱子類型上分n分配 / 吸附n離子交換n凝膠n親合液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法梯度洗脫的特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)n單位時(shí)間的分離能力增加n檢測(cè)靈敏度提高n缺點(diǎn)n儀器設(shè)備要求高n不適合某些檢測(cè)方式n柱需再生n定量分析的重復(fù)性較低如不用梯度：分離不理想梯度條件的優(yōu)化梯度曲線壓力曲線檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)器的要求n高靈敏度n可重現(xiàn)的設(shè)置n合適的帶寬n快速或可變的時(shí)間

4、常數(shù)n寬的線性響應(yīng)n容易使用及保養(yǎng)n自我診斷功能檢測(cè)器的種類996電電化化學(xué)學(xué)示示差差折折光光電電化化學(xué)學(xué)脈脈沖沖安安培培熒熒光光電電導(dǎo)導(dǎo)固固定定波波長(zhǎng)長(zhǎng)紫紫外外光光電電二二極極管管矩矩陣陣可可調(diào)調(diào)波波長(zhǎng)長(zhǎng)紫紫外外/ /可可見見可可編編程程紫紫外外/ /可可見見其其他他放放射射性性、質(zhì)質(zhì)譜譜 熱熱能能、L LA AL LL LS S 蒸蒸發(fā)發(fā)質(zhì)質(zhì)量量、粘粘度度衡量檢測(cè)器的指標(biāo)n靈敏度 S = R / QnR是檢測(cè)器響應(yīng)值的增量nQ是樣品量的增量n噪音 沒有樣品時(shí)檢測(cè)器的最大輸出信號(hào)n漂移 檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)值的變化n線性動(dòng)態(tài)范圍 最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比n最小檢測(cè)限 樣品產(chǎn)生兩或三倍于

5、噪音信號(hào)時(shí)的濃度n信噪比 S/Nn注意 最小檢測(cè)限不是一個(gè)單純的檢測(cè)器指標(biāo)。它實(shí)際上是評(píng)價(jià)整個(gè)色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此紫外-可見光檢測(cè)器n基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸收，有信號(hào)差n如是可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，還有分光系統(tǒng)(光珊)Beers Law - BEER定律n光能量n P0 = 透過溶劑的光能量n P = 透過樣品的光能量n光通量(透過率%) T=P/P0n吸光度 A = -log(T)= log(P0/P)n吸光度 = 單位吸光度 流動(dòng)池長(zhǎng)度 溶液濃度n即 A = abc濃 度透過率 %*吸光度 AU*濃 度同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因

6、素n信號(hào)強(qiáng)度(S)n從BEER定律可看出n樣品的種類n樣品濃度及進(jìn)樣的體積n檢測(cè)池的長(zhǎng)度n所使用的波長(zhǎng)，檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)n噪音(N)n流動(dòng)相n所使用的波長(zhǎng)，燈的能量n檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)n非檢測(cè)器因素 - 電噪音，泵脈動(dòng)等噪音噪音10%1%1AU.25AUS/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 25紫外檢測(cè)器的溶劑影響n不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)n溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長(zhǎng)有影響n為何溶劑質(zhì)量不好?n含紫外吸收的雜質(zhì)n溶解在其中的氧氣n緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收200 220 240 260 乙 腈甲 醇示差折光檢測(cè)器nDifferential Refractive Index

7、Detector示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)n不能做梯度實(shí)驗(yàn)n最大的池耐壓是 100 psin流速范圍是 0.3 - 10 ml/min. 液相色譜的定性及定量技術(shù)色譜峰定性n鑒別每個(gè)色譜峰n通過比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份n大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來定性即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份用保留時(shí)間定性n用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AU

8、MinutesUracilEthylparabenPropylparaben進(jìn)一步的確認(rèn)n標(biāo)準(zhǔn)加入n同時(shí)用其他方法n其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）n其他檢測(cè)器nPDA，光譜圖比較、譜庫(kù)檢索nMS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索n其他儀器方法定量分析的具體內(nèi)容n確定樣品的類型，主要成分/痕量成分n使分析條件的分離度（R）大于：1.5n色譜峰的定性，峰一致性測(cè)定n檢測(cè)限及定量限：確定靈敏度及線性范圍n用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線n檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度n用標(biāo)樣定期檢查方法痕量分析n如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：n分析前濃縮樣品n選擇高靈敏度檢測(cè)器n用衍生法n使色譜體系最優(yōu)化n使用短的微

9、徑柱（減少樣品的稀釋）n使用高效色譜柱n使k值盡可能小n增加進(jìn)樣體積和濃度n使用低流速（N增加）n采用梯度淋洗常用的定量方法n峰面積百分比法n由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用n外標(biāo)法n在液相色譜中用的最多n內(nèi)標(biāo)法n準(zhǔn)確，但是麻煩n在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多外標(biāo)法定量n配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量（二）n實(shí)際色譜圖0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u t

10、e s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s05010015020

11、025001,0002,0003,0004,0005,000樣品濃度響應(yīng)值峰面積()標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（三）n計(jì)算公式n特點(diǎn)n無需各組份都被檢出、洗脫n需要標(biāo)樣n標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致n進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確iXiiiXARFCXRXCRFii樣品響應(yīng)值未知組分的濃度標(biāo)樣響應(yīng)值標(biāo)樣濃度校正因子)()()()(內(nèi)標(biāo)法定量（一）n配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（二）n實(shí)際色譜圖0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthy

12、lParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050樣品濃度標(biāo)樣峰面積內(nèi)標(biāo)樣峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（三）n計(jì)算公式：n特點(diǎn)：n無需各組份都被檢出、洗脫n需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣n結(jié)果與進(jìn)樣體積無關(guān).)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii內(nèi)標(biāo)峰面積樣品峰面積未知組分的濃度標(biāo)樣濃度標(biāo)樣響應(yīng)值內(nèi)標(biāo)樣響應(yīng)值校正因子內(nèi)標(biāo)法定量（四）n對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求n化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)n在樣品中不存在n不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)n保留值與待測(cè)組分接近n濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)n其色譜峰與其他色譜峰

13、分離好峰面積百分比法定量n公式：n特點(diǎn)：n各組分要全部流出、全部被檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)值一樣簡(jiǎn)單，液相色譜目前很難做到這點(diǎn)n與進(jìn)樣量無關(guān)n不需標(biāo)樣n簡(jiǎn)單%100%iAiAC可接收的檢測(cè)范圍n校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤最低濃度標(biāo)樣最高濃度標(biāo)樣所希望的檢測(cè)范圍線性問題靈敏度問題檢測(cè)器響應(yīng)樣品濃度定量校正曲線n曲線A：n因在零濃度時(shí)仍有色譜峰，可能有雜質(zhì)未分開n曲線B：n在此濃度內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)值是非線性的n曲線C：n可接受的理想狀態(tài)，實(shí)際情況應(yīng)是 其延長(zhǎng)線到零點(diǎn)n曲線D：n表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也 可能是樣品制備時(shí)的損失AB

14、CD高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng) 及注意事項(xiàng)色譜柱的使用及保養(yǎng)n流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換n特別是GPC柱n流速(壓力)的變化幅度n溫度的變化幅度n專用色譜柱 樣品及溶劑的要求色譜柱的清洗n對(duì)所做的樣品要有充分的了解n用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗n硅膠柱的一般方法n先用甲醇洗去極性雜質(zhì)n用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化n鍵合相柱(烷基)的一般方法n20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的存放n存放前的處理n除去雜質(zhì)、鹽 n合適的存放溶劑n避免色譜柱床的干枯n避免機(jī)械震動(dòng)n防止細(xì)菌生長(zhǎng)n注意存放的溫度在線的保護(hù)裝置n給色譜柱提供物理的保護(hù)n除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒n給色譜柱提供

15、化學(xué)的保護(hù)n防止分析柱被化學(xué)污染n裝置n在線過濾器n自裝填料保護(hù)柱n預(yù)裝保護(hù)柱 在線過濾器在線過濾器n防止顆粒在色譜柱頭累積n優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效 保護(hù)柱保護(hù)柱n可避免化學(xué)污染。色譜泵的保養(yǎng)n流動(dòng)相要過濾n常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔n擰緊排液閥時(shí)，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)n更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過渡，要防止沉淀n進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；n避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；n每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；紫外燈的保養(yǎng)：n在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。流動(dòng)相方面n除去微粒n

16、純度的要求n超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低n緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)n緩沖液（鹽）的濃度n溶劑：色譜純，并與填料相匹配n溶劑中的雜質(zhì)含量n流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度n有機(jī)溶劑或水的比例對(duì)流動(dòng)相的要求:n除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有n與檢測(cè)器匹配n脫氣n避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）n溶劑的粘度n細(xì)菌的生長(zhǎng)流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理流動(dòng)相的脫氣n流動(dòng)相脫氣的目的n使色譜泵的輸液準(zhǔn)確n輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小n保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高n提高檢測(cè)的性能n防止氣泡引起的尖峰n基線穩(wěn)定，信噪比增加n溶劑的紫外吸收本底降低n保護(hù)色譜柱n減少死體積n防止填料的氧化流動(dòng)相脫氣的方法n加熱n簡(jiǎn)單

17、，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化n抽真空n同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果n超聲波n簡(jiǎn)單，但效果不理想。n通惰性氣體（一般用氦氣）n可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度n脫氣機(jī)n可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品方面n除去微粒及雜質(zhì)n了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度n如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出 n了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用樣品的預(yù)處理n樣品預(yù)處理的目的n除去微粒n減少干擾雜質(zhì)n濃縮微量的組份n提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性n改善分離的效果n有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品的預(yù)處理重要性n占樣品分析時(shí)間的比例n樣品預(yù)處理所用

18、時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間n占分析的消耗總成本最大n消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品n實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)n影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟是決定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法n高速離心n過濾、超濾n選擇性沉淀n衍生反應(yīng)n液-固萃取 / 液-液萃取n Sep-Pak樣品處理小柱n其他去除微粒n過濾n過濾膜/過濾裝置n有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)n膜片可更換n一次性使用的膜“Cartridge”n使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小n有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理n高速離心n大于：10,000g進(jìn)樣的注意事項(xiàng)n手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途。在HPLC系統(tǒng)中使