細(xì)胞生物室操作規(guī)范

1、細(xì)胞生物室操作規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)室是對各種動物組織細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的實(shí)驗室，具有良好的空氣凈化系統(tǒng)及多種大型精密儀器。為保證實(shí)驗室的正常工作秩序，請做到以下幾點(diǎn)：1.每天工作前打開換氣扇及紫外燈半小時，確保無菌環(huán)境。2.進(jìn)入操作間要換潔凈的白大衣、拖鞋，清洗雙手。3.操作間地面每周以新潔爾滅清潔兩次。4.CO2培養(yǎng)箱每月以70%酒精清潔一次；注意CO2濃度，及時更換氣瓶。5.倒置、熒光顯微鏡及附設(shè)照相、圖象采集分析系統(tǒng)的使用必須在專管人員指導(dǎo)下，嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行。6.培養(yǎng)的細(xì)胞要定期觀察及時換液，做好記錄，遇有污染，徹底消毒。7.操作完畢，認(rèn)真清潔超凈工作臺。8.離開實(shí)驗室前關(guān)閉各水、電閘門。各種

2、培養(yǎng)用液的配制一、平衡鹽溶液（BBS）的配制Hanks液1、 按成分表所示，準(zhǔn)確稱量試劑；許多試劑是含有水分的化合物，與不含水分者的稱量不同，應(yīng)加以換算；2、 將CaCl2先溶解于100ml水中；3、 其它成分依次溶解于750ml水中（注意應(yīng)待前一種試劑完全溶解后，再溶解下一種成）；4、 用數(shù)滴5.6%的NaCO3溶液溶解酚紅；5、 將2緩慢倒入3中，并不時攪動，防止出現(xiàn)沉淀；6、 將4加入5中；7、 將6入容量瓶中，補(bǔ)足水充分混均；8、 分裝瓶中，8磅10分鐘高壓蒸氣滅菌，4冰箱保存。二、培養(yǎng)液的制備用干粉制備培養(yǎng)液的制備1、 制備出去離子水（玻璃三蒸水）；2、 加溫水至15-30；3、 把

3、干粉加入水中，攪拌令之溶解；4、 加NaHCO3；5、 加水至最終量；6、 必要時用1HCl或1N NaOH調(diào)節(jié)pH；因濾過時pH可能受影響；7、 用0.22m濾膜濾過消毒。三、胰蛋白酶溶液的配制(1)將D-Han液高壓消滅菌，用NaHCO3液調(diào)節(jié)PH至72左右；(2)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足鹽 溶液，攪拌混勻，量室溫4小時或冰箱內(nèi)過夜，并不時攪拌振蕩；(3)次日先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，常用濃度?.25或0.125%，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)PH至72左右。星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)一、 藥品和試劑DMEM(Gib

4、co) 培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(Hyclone)、4mmol/L-谷氨酞胺(Sigma)、10萬U青霉素、10萬U鏈霉素、15mmo/L HEPES(Sigma)；0.25%、0.1%胰蛋白酶、75%酒精。二、 儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、空氣浴振蕩器、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、75m篩網(wǎng)、細(xì)胞計數(shù)器、吸管等。三、實(shí)驗對象 Wistar大鼠(天津藥物研究院提供)四、操作步驟1、出生后2d內(nèi)Wistar大鼠(天津藥物研究院提供)，無菌條件下斷頭處死，取腦，投入DHsnks平衡鹽溶液中，去除中腦、腦脊膜及大血管皮層剪碎成l一2mm3小塊，吸管吹打1m

5、in；2、025胰蛋白酶消化10min；3、1500rmin離心10min，收集沉淀，DMEM重懸；4、75m篩網(wǎng)過篩濾液1500rmin離心10 min，收集沉淀，以培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞至1×106個/毫升。接種于75cm3培養(yǎng)瓶、5%Co2，95%空氣，37飽和濕度培養(yǎng)。5、4h后換液，棄掉非貼壁細(xì)胞。6、5d后將培養(yǎng)瓶置于水平搖床，160 r/min，2h，37，換液棄除小膠質(zhì)細(xì)胞，恢復(fù)1h后重新置于水平搖床、160 r/min,18h,37,換液棄除少突膠質(zhì)細(xì)胞。8、 2d后以胰蛋白酶0.1%,8min)消化、傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長至近80%融合時用于實(shí)驗。腦皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

6、一、藥品和試劑DMEM(Gibco) 培養(yǎng)基，添加15FCS(Hyclone)、4mmol/L。L谷氨酰胺、10萬U青霉素、10萬U鏈霉素、15mmol/LHEPES；02胰蛋白酶002EDTA、2×10-5mol/L阿糖胞苷、75%酒精。二、 儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、解剖顯微鏡、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)板、75m篩網(wǎng)、細(xì)胞計數(shù)器、吸管等。三、實(shí)驗動物：16d齡Wi star大鼠四、操作步驟1、 無菌條件下。取16d齡Wi star大鼠胚胎腦，置于含7.5mmol/L葡萄糖的DMEM中，解剖顯微鏡下去除嗅球、腦脊膜、海馬和基底核、將皮質(zhì)剪

7、碎成1mm3小塊；2、 吸除DMEM，02胰蛋白酶002EDTA消化1min，10%FCS終止消化，1000 r/min離心10 min；3、 用培養(yǎng)液重懸沉淀,75m篩網(wǎng)過篩，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×106個/毫升。接種于預(yù)先涂有0.005多聚賴氨酸(ployLlysine、Sigma)的培養(yǎng)板中、5Co2、95空氣。37、飽和濕度培養(yǎng)。4、30 min后換液，棄掉非貼壁細(xì)胞；5、2d后培養(yǎng)液中添加2×10-5mol/L阿糖胞苷(A rac、Sigma)。以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。6、 以后每3天換液一半。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組織化學(xué)染色鑒定。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代

8、培養(yǎng)一、 藥品和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.2%膠原酶（型）、0.1%胰蛋白酶（1250）、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGF）、無鈣、鎂的D-Hanks液、青、鏈霉素、75%酒精。二、儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、空氣浴振蕩器、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。三、實(shí)驗對象 新生46天Wistar大鼠四、操作步驟1、取新生46天Wistar大鼠，浸泡于75%酒精消毒3min。2、將鼠仰放于無菌平皿中，在無菌條件下迅速開胸取出心臟。3、將心臟放于盛有D-Hanks緩沖液的平皿，沖洗心臟殘余血液。4、用眼科鑷去除心臟頂部瓣膜、大血管及結(jié)締組織等。5、用

9、眼科剪剪開左心室，將心臟組織放于另一盛有D-Hanks緩沖液的平皿。6、收集心臟組織置于75%酒精（去離子水配制）中浸泡30s。7、取出心臟組織于新的D-Hanks液沖洗。8、收集組織于無菌平皿中剪碎呈肉糜狀。9、收集于三角錐中，加入等體積0.2%膠原酶和0.1%胰蛋白酶，于37空氣浴振蕩器中振搖消化。10、10min后收集上清液于離心管，1200轉(zhuǎn)/分離心10min。11、角錐中加入等體積0.2%膠原酶和0.1%胰蛋白酶，繼續(xù)振搖消化。12、心結(jié)束后，傾倒離心管上清液，加入含1020%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液吹打，接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，于37，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。13、

10、 化10min后，吸取三角錐中上清液過200目網(wǎng)篩，收集于離心管，1200轉(zhuǎn)/分離心10min。14、重復(fù)步驟12。15、利用上一次離心后的上清液，加入三角錐繼續(xù)振搖消化。16、重復(fù)步驟1315約23次。最后一次去除步驟15。17、2h后，去除各培養(yǎng)瓶內(nèi)未粘附的細(xì)胞，換含10mg/L ECGF的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，于37，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)一、 藥品和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.2%膠原酶（型）、0.1%胰蛋白酶（1250）、5-溴脫氧尿苷（Brdu）、無鈣、鎂的D-Hanks液、青、鏈霉素、75%酒精。二、 儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、超凈

11、臺、醫(yī)用離心機(jī)、空氣浴振蕩器、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。三、實(shí)驗對象 新生46天Wistar大鼠四、操作步驟1. 步驟116同心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的操作。2. 2h后，收集未貼壁的心肌細(xì)胞重新懸于含1020%胎牛血清1640培養(yǎng)液中，接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，于37，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3. 前3d加用0.1mmol/L Brdu以抑制非心肌細(xì)胞生長，直至心肌細(xì)胞鋪滿瓶底即可傳代。4. 將最后一次消化剩余的心臟組織收集入75cm2培養(yǎng)瓶，加入含1020%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧損傷模型的制作一、 主要儀

12、器缺氧裝置、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。二、 操作步驟1. 將細(xì)胞標(biāo)本放于缺氧裝置B罐內(nèi)，關(guān)緊門。2. 依次打開真空泵開關(guān)、真空泵閥門、B罐開關(guān)。3. 當(dāng)真空壓力指針超過600mmHg，依次關(guān)閉真空泵閥門、真空泵開關(guān)。4. 依次打開輸氣閥開關(guān)、氮?dú)夤揲_關(guān)。5. 當(dāng)真空壓力指針歸零，依次關(guān)閉輸氣閥開關(guān)、氮?dú)夤揲_關(guān)。6. 依次打開真空泵開關(guān)、真空泵閥門。7. 重復(fù)步驟35一次。8. 重復(fù)步驟6、34，當(dāng)真空壓力指針歸零，依次關(guān)閉B罐開關(guān)、輸氣閥開關(guān)、氮?dú)夤揲_關(guān)。9. 3h后，取出細(xì)胞標(biāo)本，于37，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)一、 藥品和試劑D-Hanks液L15平衡液、胰蛋白酶

13、 (GIBCO公司)；DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)、胎牛血清(FCS，Hyclone公司)；Hepes； 75%乙醇。二、儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、小燒杯、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、25cm2培養(yǎng)瓶、離心管等。三、實(shí)驗對象 Wistar大鼠,雌性,體重150g左右。四、操作步驟1、將Wistar大鼠在嚴(yán)格的無菌條件下,取出胸腹主動脈,放入D-Hanks液中,剝離外膜,剪開動脈,用刀片輕巧地刮除內(nèi)膜,在盛有D-Hanks液的小燒杯中剪成約1mm3大小的小塊；2、吸除D-Hanks液,轉(zhuǎn)入25cm2的培養(yǎng)瓶中,在37。C5%CO2孵箱中帖壁1小時,加入含20%特

14、優(yōu)胎牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品)的DMEM(Gibco公司產(chǎn)品,加入25mM Hepes,青霉素100IU/ml,鏈霉素100IU/ml).3、在第7-8天細(xì)胞已自組織塊邊緣處長出后,去除組織塊并首次換液,以后每3天換一次液.4、待細(xì)胞生長至接近融合時開始傳代,倒去含血清的DMEM,D-Hanks液洗2次,0.25%胰酶1ml消化5-10分鐘，在倒置相差顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大后,加入含血清的DMEM終止消化,吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,倒入離心管,800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,傾去上清,以含10%胎牛血清的DMEM制成細(xì)胞懸液，分別接種于3個25cm2培養(yǎng)瓶中.5、鑒定:抗

15、actin染色(SP法):將細(xì)胞懸液接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁生長2-3天后,倒去培養(yǎng)液,TBS(0.05M,pH7.6)洗5分鐘*3次,4。C預(yù)冷丙酮固定10分鐘，TBS洗5分鐘*3次，加封閉血清，37。C孵育30分鐘，TBS洗5分鐘*3次，加一抗，抗體濃度1:100, 4。C下過夜,TBS洗5分鐘*3次,加二抗(生物素標(biāo)記兔抗山羊Ig), 37。C孵育30分鐘,TBS洗5分鐘*3次,加三抗(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液), 37。C孵育30分鐘,TBS洗5分鐘*3次,滴加DAB-H2O2顯色,常規(guī)脫水,透明封片.腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)一、 藥品和試劑IV型膠原酶、胰蛋白酶、（Si

16、gma公司產(chǎn)品）、RPMI-1640（GIBCO公司產(chǎn)品）、特等優(yōu)級胎牛血清（FCS，Hyclone公司產(chǎn)品）。二、儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、倒置顯微鏡、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（Costar公司產(chǎn)品）二、 實(shí)驗對象 遠(yuǎn)交系健康雄性Wistar大鼠，體重150200g，共12只，由國家醫(yī)藥管理局藥物研究院實(shí)驗動物室提供。四、操作步驟1. 將大鼠處死，無菌取出雙腎，取皮質(zhì)，將其剪碎，依次經(jīng)過140目、80目、200目過篩，在200目下收集腎小球細(xì)胞。2. 將提取的腎小球細(xì)胞，用無菌的1640培養(yǎng)液洗一次，離心，加入0.15%的IV膠原酶消化，37水浴8分鐘，10

17、00r/min,離心7分鐘。3. 用20%FBS1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分裝于培養(yǎng)瓶 ，放入CO2孵箱，第6-7天首次換液，以后每2-3天換液一次，待，系膜細(xì)胞布滿瓶底，進(jìn)行傳代。雪旺氏細(xì)胞原代培養(yǎng)一、 藥品和試劑L15平衡液、胰蛋白酶和膠原酶(GIBCO公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FCS，Hyclone公司)； 75%乙醇。二、儀器設(shè)備與材料無菌手術(shù)器械、超凈臺、醫(yī)用離心機(jī)、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、35細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管等。三、實(shí)驗對象 新生46天Wistar大鼠四、操作步驟1、 取新生46天Wistar大鼠脫臼處死，乙醇消毒，在無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，置L15平衡液中

18、。2、 解剖顯微鏡下仔細(xì)去神經(jīng)外膜，反復(fù)沖洗幾次后，用眼科剪將其剪成2mm3大小的碎塊，37下用0.25%胰蛋白酶和0.125%膠原酶混合液消化20分鐘，加少量小牛血清以終止反應(yīng)；3、 消化后用吸管反復(fù)吹打。以分散Schwaun細(xì)胞，細(xì)胞在DMEM10FC5培養(yǎng)液中培養(yǎng)。4、 每日觀察細(xì)胞生長狀況，1周換液2次。軟骨細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)一、 藥品和試劑胰蛋白酶，II型膠元酶，DMEM培養(yǎng)基，Gibco；青霉素，鏈霉素，Sigma；N-(2-羥乙基)哌嗪N-2-乙磺酸(HEPES)，Boehringer；抗壞血酸；谷氨酰胺，Merck；L-脯氨酸，上海政翔化學(xué)試劑研究室；維生素C注射液，齊齊哈爾第

19、二制藥廠；胎牛血清，TBD生物技術(shù)發(fā)展中心。培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基中加入4.5 g/L葡萄糖，584mg/L谷氨酰胺，15%胎牛血清，50u/ml 青霉素，50mg/ml鏈霉素，10mM HEPES，0.4 mM脯氨酸與50mg/ml抗壞血酸，過濾除菌二、儀器設(shè)備與材料超凈工作臺；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；CO2培養(yǎng)箱，美國；恒溫磁力攪拌器，81-2型，上海司樂儀器廠；離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；倒置顯微鏡，光學(xué)顯微鏡，Nikon；血細(xì)胞計數(shù)板，上海；24孔培養(yǎng)板，48孔培養(yǎng)板，Costar，美國；玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、蓋玻片、燒杯、試管、漏斗若干；手術(shù)刀，止血鉗，眼科齒鑷，眼科剪刀若干三、實(shí)驗對象

20、新生46天Wistar大鼠四、操作步驟（一）牛軟骨細(xì)胞消化分離1、 從本地屠宰場獲取4小時內(nèi)宰殺的成年牛膝關(guān)節(jié)，用0.9%NaCl溶液濕潤的無菌紗布包裹嚴(yán)密，攜至實(shí)驗室。2、 在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作，將股骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面用含有50u/ml青霉素，50g/ml鏈霉素的PBS溶液清洗干凈，用手術(shù)刀切取1mm厚的牛關(guān)節(jié)軟骨薄片，將其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小塊，從同一頭牛兩個膝關(guān)節(jié)可獲得軟骨小塊約3cm3。3、 用PBS溶液沖洗3次，置于50ml燒杯中，加入20ml 的0.25%胰蛋白酶溶液和1cm長的磁力攪拌棒，用150ml燒杯和直徑10cm的培養(yǎng)皿將其上下蓋嚴(yán)，放在37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)

21、的磁力攪拌器托盤上，以60rpm攪拌消化30min。4、 去掉胰蛋白酶溶液，將軟骨小塊用PBS溶液沖洗3次，加入15ml的0.2%II型膠原酶溶液，用與胰蛋白酶消化過程同樣的溫度和攪拌條件消化4h，分離軟骨細(xì)胞。5、 消化結(jié)束后，使細(xì)胞懸液通過孔徑45mm的尼龍網(wǎng)濾器，濾去未消化的組織殘渣，過濾后的細(xì)胞懸液以1000 rpm轉(zhuǎn)速離心10min分離細(xì)胞，棄去消化液。用配制好的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，1000 rpm轉(zhuǎn)速離心7min后棄去培養(yǎng)液，如此反復(fù)三次，可得到較為純凈的牛軟骨細(xì)胞。6、 將細(xì)胞懸浮于5ml含有4.5 g/L葡萄糖，584mg/L谷酰胺，15%胎牛血清，50u/ml 青霉素，5

22、0mg/ml鏈霉素，10mM HEPES，0.4 mM脯氨酸與50mg/ml抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基中，制成細(xì)胞懸液，備用。用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，從一頭牛的一個膝關(guān)節(jié)股骨遠(yuǎn)端收獲細(xì)胞數(shù)約為4.9×107。（二） 骨細(xì)胞消化分離取4周齡新西蘭種幼兔，處死后手術(shù)取出膝關(guān)節(jié)，然后在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作，將股骨遠(yuǎn)端與脛骨近端關(guān)節(jié)面用含有50u/ml青霉素，50g/ml鏈霉素的PBS溶液清洗干凈，用手術(shù)刀切取1mm厚的牛關(guān)節(jié)軟骨薄片，將其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小塊，以后的操作與中方法相同。從同一只家兔兩個膝關(guān)節(jié)可收獲細(xì)胞數(shù)約為2.1×107。（三） 軟骨細(xì)胞與兔軟骨

23、細(xì)胞體外培養(yǎng)及傳代1、按以上方法制得細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)液稀釋至1-2×105細(xì)胞/ml，分別接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶約4ml，塞嚴(yán)膠塞，置于37含5CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后更換培養(yǎng)液，此后3天換液一次。每天定時在倒置顯微鏡下觀察，并照像記錄。2、當(dāng)細(xì)胞貼壁生長，分泌基質(zhì)，互相連接成單層時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先棄去原培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，向25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25胰蛋白酶液4ml，置37培養(yǎng)箱內(nèi)20min。3、鏡下觀察細(xì)胞相互分離，間隙變大，細(xì)胞趨于變圓，部分呈游離態(tài)時，小心倒出胰蛋白酶液，然后加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，將細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)，再分瓶培養(yǎng)。4、瓶后的細(xì)

24、胞即為第一代，培養(yǎng)方法與原代培養(yǎng)相同。此后，按同樣方法可再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，依次得到第二代、第三代及第四代體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，定時在倒置顯微鏡下觀察，并記錄。（四）、體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的組織化學(xué)鑒定1、標(biāo)本制備將蓋玻片裁成8×8mm見方的小塊，清洗、滅菌后置于24孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)。每孔加入0.2ml濃度為9.8×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，再加入培養(yǎng)液0.5ml，蓋上蓋子，置于37含5CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后更換培養(yǎng)液，此后3天換液一次。2、組織化學(xué)染色將不同種類、不同培養(yǎng)時間、不同代的軟骨細(xì)胞標(biāo)本從培養(yǎng)液中取出，用PBS溶液沖洗2次，以梯度乙醇溶液逐級脫水，然后用1

25、茜素紅、1美藍(lán)染液染色觀察軟骨細(xì)胞，2甲苯胺藍(lán)染液染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞冰凍與復(fù)蘇1. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以胰蛋白酶與EDTA混合液消化分散（懸浮細(xì)胞除外），以培養(yǎng)液稀釋。2. 取適量細(xì)胞計數(shù)，并使成為2.5×106個細(xì)胞/ml凍存液。凍存液的成分為：RPMI-1640 80%;DMSO 10%;小牛血清 10%3. 將一毫升細(xì)胞懸液分裝于安瓿中，封口，標(biāo)記。4. 將安瓿置4 冰箱數(shù)小時，再移至-40-60冰箱12-24小時，然后立即投入液氮中。5. 復(fù)蘇細(xì)胞時，將安瓿迅速投入38-40水浴中，并充分搖動，使其迅速融化。6. 將細(xì)胞移入離心管，1000r/min離心5分鐘，棄上清

26、，加入培養(yǎng)液，置溫箱培養(yǎng)?？俁NA抽提1、細(xì)胞裂解或組織勻漿。a.貼壁細(xì)胞吸盡培養(yǎng)液，每10平方厘米細(xì)胞加入1ml Beyozol。一般六孔板每孔加1ml，12孔板每孔加0.5ml。晃動3-5下，再用槍吹打2-3下，確保全部裂解，然后吸至離心管中。b.懸浮細(xì)胞離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每五百萬至一千萬動植物或酵母細(xì)胞，或一千萬細(xì)菌，加入1ml Beyozol。用槍吹打或適當(dāng)vortex，確保全部裂解。某些酵母和細(xì)菌如裂解不充分，可用勻漿器勻漿，確保全部裂解。c.組織先將組織剪切成小塊，放入普通玻璃勻漿器內(nèi)。每50mg-80mg組織加入1ml Beyozol，勻漿。2、對于某些蛋白，多糖或脂含量很

27、高的細(xì)胞或組織，Beyozol裂解后可能會有不溶物或油脂狀漂浮物。需12,000×g 4離心10分鐘，然后吸取澄清的Beyozol裂解產(chǎn)物至一新的離心管中。3、室溫放置5分鐘，使樣品充分裂解。4、每毫升Beyozol加入0.2ml氯仿，vortex混勻或猛烈晃動15秒，室溫放置2-3分鐘。5、12,000×g 4離心15分鐘，然后吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，每毫升Beyozol約可吸取0.5-0.55ml。6、按每毫升最初的Beyozol加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀10分鐘。7、12,000×g 4離心10分鐘，在管底可見膠狀RNA沉

28、淀，棄上清。8、每毫升最初的Beyozol加入1ml75%乙醇，vortex或顛倒混勻，9、7,500×g 4離心5分鐘，棄上清。再用離心機(jī)甩一下（>5,000rpm, 離心1秒），小心吸盡液體。10、 待RNA略干后，加入20ml DEPC水溶解，-70凍存。注意，切勿讓RNA過分干燥，否則將極難溶解，且測出的A260/280值會低于1.6。注意事項：1、 有離心管，槍頭及相關(guān)溶液都必需無RNA酶污染。耐高溫器物可150烘烤4小時以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%（體積比）diethy

29、lpyrocarbonate（DEPC）至重蒸水或MiliQ級水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水。2、 必需戴一次性手套操作，且盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話，以防RNA酶污染。3、 Beyozol含有毒物質(zhì)苯酚，避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請戴防護(hù)眼鏡或使用透明保護(hù)屏。如皮膚接觸Beyozol，請立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請聽取醫(yī)生意見。PCR實(shí)驗操作規(guī)范由于PCR實(shí)驗技術(shù)要求高，影響因素很多，因此要想得到較好的實(shí)驗結(jié)果，應(yīng)注意以下幾個問題。1、 標(biāo)本模板的處理單、雙鏈DNA或RNA都可以進(jìn)行PCR，但臨床檢測標(biāo)本往往是粗提物，此對標(biāo)本的要求不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑，以及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，如果在標(biāo)本處理完全的情況下，擴(kuò)增帶不理想，則要考慮核酸解鏈?zhǔn)欠裢耆?。有時還可以考慮用Sephadex C-50柱處理標(biāo)本，得到滿意的結(jié)果。2、 引物引