轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)AFP

1、熒光定量RT-PCR 檢測(cè)AFP mRNA 基因表達(dá)方法 01020304目錄 CONTENT 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果 熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)嚴(yán)重威脅人類健康, 由于肝癌細(xì)胞容易侵犯血管, 易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。 定量檢測(cè)AFP m RNA 對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)外周血的肝癌細(xì)胞、判斷肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、治療效果及預(yù)后具有重要意義。 RT-PCR 是一種非常敏感的檢測(cè)方法, 但無論競爭RT-PCR 還是內(nèi)源性參比基因RT-PCR 定量法, 他們均屬PCR 終點(diǎn)檢測(cè)法, 在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期和平臺(tái)期產(chǎn)量相差極大, 很難對(duì)起始模板數(shù)準(zhǔn)確定量。

2、 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光定量RT-PCR 技術(shù)建立了定量檢測(cè)肝癌細(xì)胞AFP mRNA基因表達(dá)水平的方法。熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?一、實(shí)時(shí)熒光定量一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）01熒光染料02熒光共振能量轉(zhuǎn)移03PCR擴(kuò)增及其監(jiān)測(cè)04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理05實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熒光基團(tuán)通常各有單一的的光吸收峰，熒光基團(tuán)吸收激發(fā)光的能量后通常以3種方式釋放出能量。 （1）光能 （2）熱能 （3） 轉(zhuǎn)移給鄰近的分子01熒光染料熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?當(dāng)某個(gè)熒光

3、基團(tuán)的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，實(shí)際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽（猝滅）。02熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熒光PCR的獨(dú)特之處在于PCR過程中利用熒光染料在激發(fā)光下釋放的熒光能量的變化直接反應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。由于熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，通過足夠靈敏的自動(dòng)化儀器對(duì)熒光進(jìn)行采集和分析，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)PCR過程的檢測(cè)，達(dá)到對(duì)原始模板定量的目的，主要采用以下數(shù)種模式：03PCR擴(kuò)增及其監(jiān)測(cè)01仿溴乙錠著色監(jiān)測(cè)02熒光標(biāo)記引

4、物03熒光標(biāo)記探針熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熒光染料（如SYBR Green I）直接嵌入擴(kuò)增產(chǎn)物DNA雙股螺旋鏈中，通過對(duì)特定方向的強(qiáng)熒光檢測(cè)或的信號(hào)。這種模式能特異性地區(qū)分單鏈、雙鏈DNA（只與雙鏈DNA結(jié)合），缺點(diǎn)是已產(chǎn)生非特異信號(hào)，且本底較高。03PCR擴(kuò)增及其監(jiān)測(cè)01仿溴乙錠著色監(jiān)測(cè)熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理基線熒光閾值的設(shè)定Ct值值S型擴(kuò)增曲線型擴(kuò)增曲線熔解曲線熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直

5、線，這樣的直線即是基線。 一般將 PCR反應(yīng)前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（本地信號(hào)是指沒有進(jìn)樣時(shí)檢測(cè)器的信號(hào)值，與檢測(cè)器的類型有關(guān)，是無論如何也去不掉的值。測(cè)試的結(jié)果是在本底值之上增加多少的），熒光域值是PCR315個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理基線熒光閾值的設(shè)定 C代表循環(huán)數(shù)、t代表域值。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而所涉閾值都很低。Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒有被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性。Ct值值熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步

6、驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康腜CR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所作的曲線。S型擴(kuò)增曲線型擴(kuò)增曲線04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?判斷擴(kuò)增曲線是否良好的指標(biāo)主要有幾個(gè)方面： 曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基面平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，低濃度樣本擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯。 曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大擴(kuò)增效率越高。 標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降，無明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)。 各管的擴(kuò)增曲線平行型號(hào)，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。S型擴(kuò)增曲線型擴(kuò)增曲線熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原

7、理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?對(duì)PCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，到達(dá)某一溫度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。利用該特點(diǎn)以及不同PCR產(chǎn)物其Tm值的不同，因此使其熒光信號(hào)發(fā)生迅速下降的溫度也不同，可通過此對(duì)PCR的特異性進(jìn)行鑒定。熔解曲線04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?Ct與起始模板量的對(duì)數(shù)呈反比，即Y=-aX+b，其中X為濃度值對(duì)數(shù)值，Y 為Ct值。 PCR擴(kuò)增包含定量對(duì)照，即引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，配合使用PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)合二為一的儀器，利用該系列模板Ct值與已知濃度對(duì)數(shù)作

8、直線回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出位置樣品的起始模板濃度。 這種定量分析摒棄對(duì)PCR終產(chǎn)物的測(cè)定，通過監(jiān)測(cè)PCR過程中熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化，用準(zhǔn)確表征PCR對(duì)數(shù)增長規(guī)律的Ct值進(jìn)行循環(huán)實(shí)時(shí)分析。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號(hào)值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)呈反比。 研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得位置樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算

9、出該樣品的起始拷貝數(shù)（起始拷貝數(shù)就是指某基因(可以是質(zhì)粒)在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù). 單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個(gè),多則指有多個(gè)）。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熒光PCR融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)的定量精確性，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：05實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1）封閉反應(yīng)，直接探測(cè)PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果，污染因素少，且無需PCR后處理。2）靈敏度高，假陽性率低，熒光標(biāo)記探針的最大優(yōu)點(diǎn)在于其特異性非常強(qiáng)，避免了非特異性擴(kuò)增造成的假陽性信號(hào)。3）采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確。7）

10、操作安全快速4）定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)。5）計(jì)算機(jī)同步跟蹤，數(shù)據(jù)化自動(dòng)處理，在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果直觀，避免人為判斷。8）利與自動(dòng)化和聯(lián)網(wǎng)管理6）效率高，可用多種商品畫熒光物質(zhì)，如TET、FAM、HEX、JOE等作為報(bào)告熒光（3端的猝滅基團(tuán)常用TAMRA），實(shí)現(xiàn)一管雙檢或多檢。熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)越靠后，定量的重復(fù)性越差，可能有以下主要原因：1)熒光定量技術(shù)要求在低分子濃度環(huán)境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立起來的。如果分子濃度過高，影響作用復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。2)由于擴(kuò)增

11、末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。05實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、二、TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR試劑盒試劑盒熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1制品內(nèi)容熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?原理：本制品利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在以cDNA為模板利用TaKaRaEx Taq HS在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)（利用SYBR GreenI嵌合熒光法）。采用如圖所示的One Ste

12、p RT-PCR方法，反轉(zhuǎn)錄以總RNA為模板，利用反應(yīng)引物合成cDNA，在以此為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。01制品原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理 應(yīng)用生物信息學(xué)知識(shí), 從基因庫中查閱出AFP的DNA和mRNA序列。 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則, 并利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)軟件, 設(shè)計(jì)出擴(kuò)增AFP mRNA基因片段的上

13、下游引物和探針。PCR實(shí)驗(yàn)成功的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是引物的設(shè)計(jì)。3引物、探針的設(shè)計(jì)和合成引物、探針的設(shè)計(jì)和合成熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理用上述提取的的總RNA , 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。反應(yīng)體系:主要包含上下游引物、各種酶、底物、模板和Mg2+5種物質(zhì)?，F(xiàn)在以TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR試劑盒為例作為整個(gè)反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:針對(duì)不同的引物，設(shè)定最佳的退火溫度是QRT-PCR反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。具體反應(yīng)程序包括反轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性、變形、退火、延伸等。所有過程的反應(yīng)溫度和作用時(shí)間均應(yīng)經(jīng)過篩選確定最佳反應(yīng)條件。具體反應(yīng)條件的參考值見表1，可在參考值范圍內(nèi)

14、加減選擇最佳條件。根據(jù)擴(kuò)增片斷長度, 擴(kuò)增產(chǎn)物用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳, 在紫外燈下割取特異性的條帶, 用QIAquick Gel Extraction Kit(德國Qiagen公司)試劑盒（用于純化DNA）進(jìn)行純化。4RT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增AFP mRNA熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理用RNase Free dH2O（用于溶解難溶于水的RNA）將總RNA稀釋到0.2g/l，作為濃度最高的模板（20,1號(hào)）。然后取11個(gè)容量為150l的離心管（212號(hào)），分別加入10lRNase Free dH2O。從1號(hào)管中取10l加到2號(hào)管中，稀釋倍數(shù)為1。以此類推，如圖所

15、示，將1號(hào)主機(jī)2倍稀釋成，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理將倍比稀釋的總RNA作為QRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，應(yīng)用確定的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律生成標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線、熔解曲線、和標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熔解曲線上應(yīng)該有且只有一個(gè)明顯的峰，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值須非常均一，表明沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物及引物二聚體。5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作熒光定量RT-PCR應(yīng)用5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理熒光定量RT-PCR應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟及可能結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理 制作出最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線之后，就建立了檢測(cè)AFP表達(dá)的方法。 要檢測(cè)細(xì)胞中AFP是否異常表達(dá)，即可選取待檢測(cè)的細(xì)胞重復(fù)前面的步驟，最后通過電腦得出該細(xì)胞RNA的Ct值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出它的起始拷貝數(shù)，根據(jù)此數(shù)據(jù)來判斷是否異常表達(dá)。6