正葡萄糖鉗夾實驗

1、口服口服胰島素腸溶胰島素腸溶膠囊的膠囊的藥代動力學藥代動力學與與藥效藥效動力學動力學研究實驗研究實驗（一）、歷史背景 1966年Andres等根據(jù)葡萄糖一胰島素的負反饋原理，創(chuàng)立了一種可定量分析胰島素分泌及作用的方法葡萄糖鉗夾技術。1979年De Fronzo等對該技術從理論上作了詳細的闡述，并給予技術指導，推動了世界范圍的廣泛應用。萄糖鉗夾技術根據(jù)研究目的的不同又劃分為高糖鉗、正糖鉗及低糖鉗等不同方法。（二）、技術原理1、葡萄糖一胰島素負反饋體系 血糖升高時，胰島素分泌增加，并通過增加攝取、儲存和利用葡萄糖等方式，下調血糖；血糖下降，胰島素分泌降低，胰高血糖素等升糖激素增加，促進代謝分解，加

2、速糖原分解和葡萄糖異生作用，升高血糖。2、鉗夾技術原理 正糖鉗技術通過同時輸注可控濃度及速率的外源性胰島素和葡萄糖，打破體內葡萄糖一胰島素的負反饋調控，使血漿外源性胰島素維持在較高濃度水平，而血糖維持在基礎穩(wěn)態(tài)水平。由于血漿外源性胰島素的優(yōu)勢濃度，抑制了內源性葡萄糖(肝糖分解和糖異生)和內源性胰島素分泌，此時外源性葡萄糖輸注速率等于外周組織的葡萄糖利用率，從而評價葡萄糖、胰島素以及其他相關物質的代謝過程。（三）、特點1、避免了內源性胰島素缺乏(如糖尿病患者)及低血糖(如胰島素耐量試驗中)對胰島素敏感性測定的影響。2、將內源性干擾減至最小，增加了實驗的可控性與準確性，降低了結果的變異性。（四）、

3、缺點1、不同受試者的應激反應和血管緊張度等諸多因素會對穩(wěn)態(tài)的建立產生一定的影響。2、該技術復雜耗時、費用昂貴，實驗中需頻繁取血。（五）、實驗方法1、建立靜脈輸液通道及采血通道在前臂靜脈或正中靜脈穿刺并留置導管建立輸液通道，用于輸入胰島素和葡萄糖溶液。葡萄糖和胰島素輸注通道經三通管與靜脈通道聯(lián)接。采血通道由輸液器、三通管、帶延長的三通管、靜脈留置針依次串連在一起，2個三通管的側孔分別接上注射器，并保持管道通暢。2、鉗夾實驗試驗前比格犬禁食12h，試驗時用巴甫洛夫吊帶將比格犬固定于實驗臺上。在動物一側前肢建立靜脈通道，該通道連接三通管，一端連接胰島素注射泵，一端連接葡萄糖輸注泵。鉗夾開始后10mi

4、n內以較快的速度輸注胰島素，以使血胰島素水平快速升高，而后以較低的速度持續(xù)輸注維持一定血胰島素濃度。在靜脈通道對側前肢取血測量血糖，每隔5min取血測量血糖一次，通過調節(jié)葡萄糖輸注率以維持血糖水平恒定。經一段時間后、血糖恒定維持于平衡狀態(tài)。給胰島素制劑后,葡萄糖輸注率隨著胰島素產生的作用變化，以此來評價胰島素制劑的藥效動力學特征。3、正糖鉗技術指標 鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下血糖(SSPG)：SSPG需控制在正?？崭寡?0范圍內。 鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下胰島素(SSINS)：較高的血漿外源性胰島素水平才能抑制內源性肝糖及胰島素的生成，滿足實驗要求。 血糖變異系數(shù)(CVBG)：鉗夾實驗期間CVBG可反映鉗夾技術的

5、穩(wěn)定性與準確性。 穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注速率(SSGIR)：SSGIR等于外周組織的葡萄糖利用率，可用來評價外周組織(主要是肌肉組織)胰島素作用，反映機體組織的胰島素敏感性。 內源性胰島素分泌：c肽水平可評估內源性胰島素分泌，粗略判斷內源性胰島素分泌的抑制程度。二、RIA方法測定血清樣品中胰島素抗原濃度（一）原理 將一定量的胰島素標記示蹤物和待測樣品混合，加入豬胰島素抗體,通過標記示蹤物和待測樣品與抗體的特異性競爭結合。加入沉淀劑后,與抗體結合的標記示蹤物在沉淀中，結合的標記示蹤物與待測胰島素樣品的量成反比。計數(shù)儀計數(shù)越高，對應的胰島素樣品的濃度越低。（二）實驗方法1、采樣 各組動物于給予胰島素制劑前

6、及給藥后每隔30min取血,直至鉗夾結束。全部血樣均于凝固后離心獲得血清，血清樣品于-20保存。采用RIA方法檢測其中的豬胰島素抗原濃度，用于胰島素血清藥代動力學的計算。2、測定NSB管(非特異性結合管)加300ml分析液，Bo管(參比管)加200ml分析液，其他管加100ml分析液。在其它分析管中加100oL標準品、質控樣品或待測血清樣品，各管加入100l 125I-Insulin，然后各管(除Total count tubes與NSB管)加入100ml豬胰島素抗體，混合均勻，封閉，4oC過夜。20小時以后各管加1ml的冷凍沉淀劑，渦旋，孵育20min，4oC。離心30min，立即傾出上清，

7、于計數(shù)儀上計數(shù)各管。各批分別設置豬胰島素標準校正曲線，用以計算該批所測未知樣品濃度。（三）結果計算 用MicroCal公司Origin5.0對濃度對數(shù)和各管放射計數(shù)與總計數(shù)的比值對數(shù)繪制標準曲線，四參數(shù)Logistic擬合：（四）PKPD參數(shù)的計算和統(tǒng)計分析 用MierosoftExee1XP軟件采用統(tǒng)計矩方法計算各藥效動力學與藥代動力學參數(shù)。PK或PD曲線下面積用梯形法進行計算。達峰時間與峰濃度均為實測值。比格大自身交叉對照組數(shù)據(jù)比較用StudentS配對t一檢驗法進行統(tǒng)計判斷,其它處理組組間t一檢驗進行統(tǒng)計學判斷。用Origin軟件對實驗結果進行線性回歸求回歸方程及相關統(tǒng)計參數(shù)，并作圖。三

8、、相關分析技術三、相關分析技術（一）放射免疫分析(RIA)方法 放射免疫技術為一種將放射性同位素測量的高度靈敏性、精確性和抗原抗體反應的特異性相結合的體外測定超微量物質的新技術。應用放射性同位素標記的抗原或抗體，通過免疫反應測定的技術，都可稱為放射免疫技術，經典的放射免疫技術是標記抗原與未標抗原競爭有限量的抗體，然后通過測定標記抗原抗體復合物中放射性強度的改變，測定出未標記抗原量。它可以分為兩類：競爭性RIA和非競爭性RIA，也稱為免疫放射分析。（二）統(tǒng)計矩方法1、應用藥物動力學研究的統(tǒng)計矩分析，是一種非隔室的分析方法，它不需要對藥物設定專門的 隔室，也不必考慮藥物的體內隔室模型特征。2、目前這種分析方法主要適用于體內過程符合線性動力學的藥物。（三）