變性梯度凝膠電泳DGGE試驗

1、變性梯度凝膠電泳（DGGE）實驗一.DGGE的實驗原理變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。DGGE（denaturinggradientgelelectrophoresis許是將分子量不同的DNA分開，而是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開。該方法的原理是根據(jù)DNA的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發(fā)生變性所要求的變性劑濃度不同，混合雙鏈DNA在變性劑濃度呈線性梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，當(dāng)泳動到與DNA變性所需變性劑濃度一致的凝膠位置時，相對應(yīng)的DNA發(fā)生解鏈變性，導(dǎo)致電泳遷移速率降低。由于泳動受阻DNA分子在

2、凝膠中的停留位置不同，從而使不同DNA分子得以分離。根據(jù)變性劑梯度方向的不同，DGGE可分為:垂直DGGE,即變性劑梯度與電場方向垂直，常用于試驗決定分離型、野生型和變異型的最佳變性劑梯度范圍；平行DGGE,其變性劑的梯度和電場方向平行，主要用于解鏈范圍明確的DNA片段的檢測。DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌，古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息并同時分析多個樣品，具有可重復(fù)和操作簡單等特點，適合于調(diào)查種群的時空變化，并且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。然而一旦變性劑濃度達(dá)到DNA片段最高解鏈區(qū)域濃度時，D

3、NA片段會完全解鏈，成為單鏈DNA分子，此時他們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此如果不同DNA片段的序列差異發(fā)生在最高解鏈區(qū)域時，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個堿基對）可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列，它的解鏈溫度很高可以防止DNA片段在膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中的每個堿基處的序列差異都能被分開。二.DGGE主要步驟DGGE對微生態(tài)的分析一般包括三個步驟：核酸提取、16SrRNA序列的PCR擴(kuò)增以及DGGE指紋圖譜分析。1.核酸提取微生物總DNA的提取是整個分子生物學(xué)技術(shù)

4、的基礎(chǔ)，是否能獲得具有代表性的總DNA樣品將決定后續(xù)分析的可行性。一般認(rèn)為微生物提取總DNA的方法分為細(xì)胞裂解和核酸抽提兩個步驟。細(xì)胞裂解有三種：機(jī)械法、化學(xué)法和酶法。機(jī)械法包括玻璃珠法、超聲波法、凍融法等；化學(xué)法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K和溶解酶等。2.16SrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增細(xì)菌按沉降系數(shù)分為5S、16S和23S三種,16SrRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼該rRNA的相應(yīng)DNA系列。16SrRNA基因序列全長1540bp，有保守區(qū)和可變區(qū)之分，每種細(xì)菌的保守區(qū)都是相同的，能反映生物種類的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索；可變區(qū)因細(xì)菌種類而異，通過保守區(qū)設(shè)計

5、引物，擴(kuò)增出可變區(qū)，就可以得知微生物多樣性信息。大多數(shù)情況下，可根據(jù)16SrRNAV3區(qū)和V6-V8區(qū)設(shè)計細(xì)菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有時為了更加準(zhǔn)確得獲得微生物多樣性的信息可先通過細(xì)菌16SrRNA序列全長通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對V3或V6-V8區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。3.水平變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向水平o所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0100%。其中，含尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。操作步驟：1)試劑準(zhǔn)備：(1) 40%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(37.5:1,4C保存)：38.93克丙烯酰胺，1.07克甲叉雙丙

6、烯酰胺溶解定容于100mL超純水中。(2) 0.5MEDTA溶液：稱取18.7克EDTA加超純水溶解并調(diào)節(jié)pH值到8.0,總體積定容到50mLo(3) 50kAEBuffer(室溫保存)：121克Tris堿，28.55mL冰醋酸溶解到上述EDTA溶液中，加超純水溶解至總體積500mL0(4) 0%變性劑(4C保存，一個月內(nèi)用完)：取15mL40%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液和2mL的50kAEBuffer加超純水定容至100mL。(5) 100%變性劑(4C保存，一個月內(nèi)用完)：取15mL40%的丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液、2mL的50kAEBuffer、40mL甲酰胺、42克尿素溶解于超

7、純水中至總體積100mL。(6) 10%過硫酸錢(-20C)：0.1克過硫酸錢溶解到1mL超純水中。2)準(zhǔn)備膠板：(1)預(yù)先準(zhǔn)備清洗晾干的原配玻璃板。用洗潔精和紗布洗去表面可能殘存的膠與油污，用自來水反復(fù)沖洗后再用去離子水沖洗干凈，自然晾干，必要時以酒精擦洗玻璃板徹底去除油脂，油脂對電泳質(zhì)量有較大影響。打開電泳控制裝置,預(yù)熱電泳緩沖液到60C。配置7L的1XTAE緩沖液,電泳槽內(nèi)電泳液的體積需加至藍(lán)色記號線的位置，不可超過有FULL標(biāo)識的記號線位置。建議電泳2次更換緩沖液。(2)制膠板的安裝。取兩塊潔凈的玻璃板一大一小，將剩余的水珠用濾紙吸去，在大板與小板中間墊上兩片SPACER,兩邊對齊，兩

8、個SPACER正面上方的凹槽正好形成八"字狀在玻璃板的兩側(cè)。讓玻璃板邊上稍微露出一點SPACER,然后在兩邊裝上塑料玻板夾，雙手拍緊，使SPACER正好夾在兩玻璃板縫隙間，然后雙手轉(zhuǎn)動玻板夾上端旋鈕，適當(dāng)夾緊，不可過于用力。(3)檢查三明治結(jié)構(gòu)，先確定玻璃板底部SPACER能觸至IJ底，與玻璃板切面平齊，這樣不容易漏膠。然后檢查兩邊的玻板夾，確定白色滑片保持垂直，與夾子保持平行(這點很重要，如果滑片沒有靠近夾子，很容易因為旋緊的夾子受熱膨脹而斷裂)，最后雙手同步旋緊旋鈕。(4)調(diào)節(jié)制膠架水平不搖晃，否則會影響條帶會聚。將海綿墊固定在制膠架上，把類似土明治”結(jié)構(gòu)的制膠板系統(tǒng)垂直放在海綿

9、上方，用分布在制膠架兩側(cè)的偏心輪固定好制膠板系統(tǒng)，方法是雙手按住旋鈕，同步旋轉(zhuǎn)，直到旋鈕閥朝下，手感應(yīng)該較緊了。注意一定是短玻璃的一面正對著自己。(5)取少量瓊脂糖膠融化，用來封住架好的玻璃板下沿縫隙，防止漏膠。3)灌膠：(1)自動灌膠裝置裝配好，加入去離子水清洗并檢查連通器中間是否有阻塞物，灌膠的針頭是否有阻塞物，然后用濾紙將灌膠裝置內(nèi)部擦干。開啟恒流泵，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為15轉(zhuǎn)/分鐘，按清零”使泵反向轉(zhuǎn)動。(2)配制變性劑，關(guān)閉連通器中間的閥門，在左邊低濃度槽內(nèi)加入8.75mL的0%變性劑，緩緩打開連通器中間的閥門，使液體恰好充滿中間的連接處，然后關(guān)閉閥門，打開攪拌器調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)子位置至混合力度最

10、大。在右邊高濃度槽內(nèi)加入5mL的0%變性劑，然后在左右兩邊的槽內(nèi)分別加入3.75mL和7.5mL的100%變性劑。這時兩邊液面應(yīng)該大致平齊。(3)在兩個槽內(nèi)各加入60仙1的APS和30仙1的TEMED,隨即打開連通器閥門和消零”按鈕，使液體流向針頭。將針頭固定于長玻璃板的上端中央位置，對準(zhǔn)兩塊玻璃板的縫隙不要移動。每塊膠板總體積是25mL,大約7分鐘左右灌好一塊膠。待連通器中的膠全部進(jìn)入膠管中一會，往連通器中加入去離子水，保持流速，待膠灌好后，輕輕的左右勻速移動加入干凈的去離子水至液面與短板相平齊。(4)移開灌膠針頭到瓶，給連通器中加滿去離子水清洗，按排氣”按鈕使最大速度排水，洗凈后倒扣放置。

11、(5)下層膠常溫下半個多小時就可以凝固。傾去上層的水，用濾紙吸干殘液，但是不要碰到膠。把梳子垂直地插入到膠板中央擺正。(6) 配制上層膠。一塊膠的膠液：3mL的0%變性劑，15仙L的TEMED和30仙L的APS,迅速攪拌均勻并用200的移液槍轉(zhuǎn)移到已凝固的膠上方，直到與短板平齊，防止在梳子下產(chǎn)生氣泡。上層膠凝固時間略長，需要一個40分鐘到一個小時左右。待上層膠凝固后，小心拔出梳子，用洗瓶沖去可能留在點樣孔附近的殘膠，確保每個點樣孔都是豎直平行的，沒有殘余東西在里面。如果里面有殘余膠或者上樣膠扭曲，可以用一次性針頭矯正，不正的上樣孔會影響條帶寬度和走向。4)膠板裝配槽架：(1)把制好的膠板推入電

12、泳槽架，注意短玻璃板與電泳夾子上白色墊片壓緊以防止電泳液從縫隙漏出。如果開啟電泳泵后發(fā)現(xiàn)漏水，可以再此縫隙處涂上凡士林。將玻板夾的旋鈕反向旋松約1/4圈，防止高溫下夾子斷裂。(2)每次可以同時跑兩塊膠，如果只有一塊膠，則需要另一套板配合構(gòu)成上槽，使緩沖液浸沒過短玻璃板和電極絲。如果只跑一塊膠，另一套板中間不要墊SPACER,兩塊玻璃板合并就可以。(3)緩沖液加熱到60度后先關(guān)掉電源，把電泳架放置入電泳槽，蓋上電泳槽頂蓋，重新開啟加熱器和水泵。5分鐘后可見，電泳液被泵到長玻璃板上端，沒過電泳夾子上的電極絲，待重新加熱到60度后即開始點樣。5)點樣：上樣液是30L以內(nèi)的DNA樣品溶液，兩者混合后按

13、序依次加到上樣孔，一般一塊膠兩邊的各兩個孔不上樣，建議中間的上樣孔留一個給marker,這樣marker比較直，分離效果好，適合用來比對條帶。6)電泳：插上電極，打開電泳控制器，先把電壓調(diào)到160V,再調(diào)時間到4.5小時，按開始按鈕。電泳開始后，為了防止電泳期間發(fā)生故障無人照看，建議4小時內(nèi)不要遠(yuǎn)離DGGE電泳儀，經(jīng)常檢查儀器是否正常運轉(zhuǎn)。7)剝膠與染色：(1)小心取下三明治玻璃板夾子，迅速把兩塊玻璃板帶膠放入已經(jīng)盛有冷的蒸儲水的染色盤中，短玻璃板朝上放置。待玻璃板溫度降下來后，扳動SPACER,把短玻璃板撬起來，小心晃動染色盒，使膠從長玻璃板上脫離下來。(2)讓浮起的膠全部漂到長玻璃板上端，輕輕按住膠，把盤中的水倒凈。(3)按1:10000倍稀釋染料3到30mL的1kAE緩沖液中，混勻后用5mL移液槍吸取均勻噴灑到膠表面，確保所有表面都覆蓋到。每次用量10mL,間隔15分鐘，共分三次將染色液均勻涂布在膠表面。(4)染色完后，倒去染色液，倒入清水，使膠再次懸浮起來。小心托起長玻璃