酶工程第1章酶活性單位及其測定方法

1、第一章 酶活性單位及其測定方法一、酶活性單位一、酶活性單位二、酶活性測定的主要方法二、酶活性測定的主要方法酶的活性 在酶的分離純化、性質(zhì)研究以及酶制劑的生產(chǎn)在酶的分離純化、性質(zhì)研究以及酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用時(shí)，都要遇到對酶的活性、純度及含量進(jìn)行和應(yīng)用時(shí)，都要遇到對酶的活性、純度及含量進(jìn)行經(jīng)常的、大量的測定工作，這是必不可少的指標(biāo)。經(jīng)常的、大量的測定工作，這是必不可少的指標(biāo)。 要研究某種酶，首先必須建立起該酶活性的測要研究某種酶，首先必須建立起該酶活性的測定方法。定方法。 酶活性酶活性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力，檢查是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力，檢查酶的含量及存在，通常是用該酶在酶的含量及存在，通

2、常是用該酶在一定條件一定條件下催化下催化某一特定反應(yīng)的某一特定反應(yīng)的速度速度，即酶的活性來表示。，即酶的活性來表示。 一、酶活性單位 酶活性指的是酶制劑催化能力的大小，它既與酶活性指的是酶制劑催化能力的大小，它既與酶分子的濃度酶分子的濃度（量）有關(guān)，又與（量）有關(guān)，又與酶分子催化能力酶分子催化能力的的大?。ㄙ|(zhì)）有關(guān)。人們規(guī)定一定的催化能力為一個(gè)大小（質(zhì)）有關(guān)。人們規(guī)定一定的催化能力為一個(gè)酶活性單位。酶活性單位。液體酶制劑液體酶制劑的酶濃度用單位體積酶制的酶濃度用單位體積酶制劑所含的酶活性單位來表示，即劑所含的酶活性單位來表示，即u/ml。對于。對于固體狀固體狀態(tài)的酶制劑態(tài)的酶制劑，其酶含量可用

3、單位質(zhì)量酶制劑所含的，其酶含量可用單位質(zhì)量酶制劑所含的酶活性單位來表示，即酶活性單位來表示，即u/mg。國際酶活性單位 1961年，國際酶學(xué)會議為酶活性單位規(guī)年，國際酶學(xué)會議為酶活性單位規(guī)定了一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，即在特定的條件下定了一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，即在特定的條件下（一般為酶催化反應(yīng)的最適條件），（一般為酶催化反應(yīng)的最適條件），1分鐘轉(zhuǎn)分鐘轉(zhuǎn)化化1mol底物底物，或轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)化1N底物有關(guān)基團(tuán)底物有關(guān)基團(tuán)所所需的酶量需的酶量為為1個(gè)個(gè)國際單位（國際單位（IU）。Katal 1972年，國際酶學(xué)委員會提出了一個(gè)新年，國際酶學(xué)委員會提出了一個(gè)新的酶活單位，叫的酶活單位，叫katal（kat），katal

4、是一個(gè)很是一個(gè)很大的酶活單位，大的酶活單位，1 katal是指是指1秒鐘轉(zhuǎn)化秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底底物物，或轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)化1N底物有關(guān)基團(tuán)所需的酶量。底物有關(guān)基團(tuán)所需的酶量。 1 katal6107 IU 實(shí)用單位 對對不同的酶采用不同的定義。不同的酶采用不同的定義。DNA聚合酶聚合酶的單位：的單位：在特定反應(yīng)條件下，在特定反應(yīng)條件下，30分鐘分鐘內(nèi)催化內(nèi)催化10nmol dNTP合成為合成為TCA（三氯乙酸）（三氯乙酸）不溶物所需的酶量。不溶物所需的酶量。T4 DNA連接酶的單位：連接酶的單位：在在20l反應(yīng)體積中，反應(yīng)體積中，16，30分鐘分鐘內(nèi)，將內(nèi)，將50%的的Hind 酶切的酶切的DNA片

5、段重新連接起來所需的酶量。片段重新連接起來所需的酶量。ACC合成酶的單位：合成酶的單位：30，1小時(shí)轉(zhuǎn)化小時(shí)轉(zhuǎn)化SAM（硫（硫腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）生成生成1nmol ACC（1-氨基氨基-1-羧基羧基-環(huán)丙烷）環(huán)丙烷）所需的酶量。所需的酶量。 轉(zhuǎn)換數(shù) 在在標(biāo)準(zhǔn)條件標(biāo)準(zhǔn)條件下，下，每摩爾每摩爾單體酶或每摩爾催化單體酶或每摩爾催化中心在中心在1分鐘分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)換底物成產(chǎn)物的內(nèi)轉(zhuǎn)換底物成產(chǎn)物的mol數(shù)數(shù)，可表示，可表示為：為： 1/Kp為一個(gè)催化循環(huán)，單位為分鐘。為一個(gè)催化循環(huán)，單位為分鐘。 比活性 酶的純度酶的純度往往用比活性來表示，比活性是往往用比活性來表示，比活性是用同一酶制劑的用同一酶制

6、劑的酶活性除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量酶活性除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量，即，即單位質(zhì)量蛋白質(zhì)單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所具有的酶活性，常用的單位所具有的酶活性，常用的單位為為u/mg protein。酶制劑的比活性越高說明酶。酶制劑的比活性越高說明酶的純度越高。的純度越高。例題 分子量為分子量為20,000的的20g純酶在最適條件下催純酶在最適條件下催化反應(yīng)的速度為化反應(yīng)的速度為0.3mol/min，計(jì)算此酶制劑的比，計(jì)算此酶制劑的比活力?；盍Α?mol/min/mg protein U/mg protein10000.31520二、酶活性測定的主要方法 溫度、溫度、pH、離子強(qiáng)度（、離子強(qiáng)度（I=(1/2)CZ2）等因）等因

7、素對酶活性有很大的影響，測定酶活性時(shí)一般素對酶活性有很大的影響，測定酶活性時(shí)一般采采用最適環(huán)境條件用最適環(huán)境條件。若酶催化反應(yīng)時(shí)需要輔助因子，。若酶催化反應(yīng)時(shí)需要輔助因子，應(yīng)加入應(yīng)加入最適量的輔助因子最適量的輔助因子。底物濃度應(yīng)。底物濃度應(yīng)采用零級采用零級反應(yīng)時(shí)的底物濃度反應(yīng)時(shí)的底物濃度，這時(shí)反應(yīng)速度只與酶濃度有，這時(shí)反應(yīng)速度只與酶濃度有關(guān)，而與底物濃度無關(guān)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物關(guān)，而與底物濃度無關(guān)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物濃度越來越高，而底物濃度越來越低，導(dǎo)致反應(yīng)濃度越來越高，而底物濃度越來越低，導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，所以測酶活性時(shí)應(yīng)速度下降，所以測酶活性時(shí)應(yīng)測反應(yīng)的初速度測反應(yīng)的初速度，即反應(yīng)開始

8、后較短一段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度（反應(yīng)即反應(yīng)開始后較短一段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度（反應(yīng)了的底物不超過了的底物不超過5%）。）。 1 1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸還原酶硝酸還原酶將將NO3 還原成還原成NO2，NO2 與加與加入的顯色劑對氨基苯磺酸和入的顯色劑對氨基苯磺酸和萘胺反應(yīng)生成萘胺反應(yīng)生成玫玫瑰紅色瑰紅色的偶氮化合物，在的偶氮化合物，在520nm處比色可測定產(chǎn)物處比色可測定產(chǎn)物的生成量。一些的生成量。一些脫氫酶脫氫酶以以NAD+或或NADP+為輔酶為輔酶，NAD+或或NADP+在在340nm處光吸收很少，而其還原處光吸收很少，而其還原形式形式NADH和和NADPH在在3

9、40nm處光吸收較大，因處光吸收較大，因此可以測定此可以測定340nm處的光吸收變化來檢測處的光吸收變化來檢測NADH和和NADPH的生成或減少，從而得知脫氫酶的活性。的生成或減少，從而得知脫氫酶的活性。乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶2 2 旋光測定法 若底物和產(chǎn)物的旋光性不同，可通過測定若底物和產(chǎn)物的旋光性不同，可通過測定反應(yīng)混合物的反應(yīng)混合物的旋光性旋光性（方向和大?。┳兓瘉頊y（方向和大小）變化來測定酶活性。定酶活性。（polarimetry） 3 3 熒光法（fluorescence） 氧化態(tài)的黃氧化態(tài)的黃素素（flavin）化合物發(fā)出強(qiáng)烈的熒）化合物發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，還原態(tài)失去

10、熒光。光，還原態(tài)失去熒光。NAD+ 和和NADP+無熒光無熒光，而而NADH和和NADPH有有460nm藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光。熒光法靈。熒光法靈敏度高。敏度高。4 4 同位素測定法（isotope determination） 用放射性同位素標(biāo)記底物，酶反應(yīng)后分離產(chǎn)用放射性同位素標(biāo)記底物，酶反應(yīng)后分離產(chǎn)物，測產(chǎn)物的物，測產(chǎn)物的放射性強(qiáng)度放射性強(qiáng)度。此法靈敏度高，但分。此法靈敏度高，但分離產(chǎn)物較麻煩。若底物或產(chǎn)物中有一種是氣體或離產(chǎn)物較麻煩。若底物或產(chǎn)物中有一種是氣體或沉淀，就易于分離。沉淀，就易于分離。5 5 電化學(xué)方法（electrochemistry） pH測定：測定：對于某些酶促反應(yīng)過程中會

11、對于某些酶促反應(yīng)過程中會產(chǎn)生產(chǎn)生H或減少或減少H的反應(yīng)來說，用的反應(yīng)來說，用1/1000 pH單位精度單位精度的的pH計(jì)測定反應(yīng)液的計(jì)測定反應(yīng)液的pH變化，或?yàn)楸３肿兓?，或?yàn)楸３謕H不變而加入不變而加入酸或堿，記錄一段時(shí)間內(nèi)加入的酸堿量。酸或堿，記錄一段時(shí)間內(nèi)加入的酸堿量。 電位測定：電位測定：在一些酶促氧化還原反應(yīng)中，底物在一些酶促氧化還原反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物具有不同的氧化還原電位，可用由一恒定微和產(chǎn)物具有不同的氧化還原電位，可用由一恒定微電流極化的兩個(gè)鉑電極之間的電流極化的兩個(gè)鉑電極之間的電位差來測定電位差來測定電位變電位變化?；?。 電流測定：電流測定：以以恒定電壓恒定電壓的兩個(gè)鉑電極測電流的兩個(gè)鉑電極測電流變化。變化。6 6 化學(xué)分析法（chemical analysis） 酶促反應(yīng)一段時(shí)間后，取出一部分反