高效液相色譜方法及應(yīng)用

1、1高效液相色譜方法及應(yīng)用2主要內(nèi)容v緒論v高效液相色譜法的特點(diǎn)v高效液相色譜法的分類v化學(xué)鍵合相色譜v高效液相色譜儀v定性、定量分析基本原理v在藥物分析中的應(yīng)用3 高效液相色譜法高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC） 是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。 4v經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)v引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)v高壓輸送流動(dòng)相v高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器v現(xiàn)代液

2、相色譜分析方法5“三高一廣一快三高一廣一快”高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻 力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓，一般可達(dá)150350105Pa 。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng/ml，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級(jí)。 6“三高一廣一快三高一廣一快”應(yīng)用范圍廣：80%以上的有機(jī)化合物可用HPLC分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。 分析速度快、載液流速快：通常分析一個(gè)樣品僅需幾分鐘到幾十分鐘的時(shí)間，一般小于1小時(shí)。 色譜柱可反復(fù)使用、樣

3、品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)7 局限性：局限性：v使用多種溶劑作為流動(dòng)相，成本高于氣相色譜法，且易引起環(huán)境污染，梯度洗脫操作復(fù)雜； v “柱外效應(yīng)” ：在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低；v高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜；v不能代替中、低壓柱色譜法，在200KPa至1MPa柱壓下去分析受壓易分解、變性的具有生物活性的生化樣品。 81經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 柱效低（H，n） 分析周期長(zhǎng)

4、無(wú)法在線檢測(cè)92HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動(dòng)相 柱效高（H，n） 分析時(shí)間大大縮短 可以在線檢測(cè)10HPLC與與GC差別差別相同：兼具分離和分析功能 均可以在線檢測(cè)不同： 1分析對(duì)象的區(qū)別 2流動(dòng)相的區(qū)別 3操作條件區(qū)別 11HPLC與與GC差別差別1分析對(duì)象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè)，占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的

5、生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)，用途廣泛，占有機(jī)物的80%12HPLC與與GC差別差別2流動(dòng)相的區(qū)別 GC：流動(dòng)相為惰性氣體，氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì)分離起正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改變流動(dòng)相極性和pH值也對(duì)分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相也可以增大分離選擇性。13HPLC與與GC差別差別3操作條件區(qū)別 GC：加溫操作 HPLC：室溫，高壓（液體粘度大，峰展寬?。?4HPLC的分類的分類根據(jù)分離機(jī)制不同分為根據(jù)分離機(jī)制不同分為: 1

6、、液固吸附色譜法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 2、液液分配色譜法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography ) 3、離子色譜法（IC） ( ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 4、空間排阻色譜法（SEC） ( steric exclusion chromatography )15其他色譜類型其他色譜類型：v親和色譜（Affinity

7、 Chromatography; AC）v手性色譜法（Chiral Chromatography；CC）v膠束色譜法（Micellar Chromatography；MC）v電色譜法（Electrochromatography；EC）16液液固色譜法固色譜法v固定相：固體吸附劑（如硅膠、氧化鋁等，粒度510m）v流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑v基本原理：溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異；分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過(guò)程17液液固色譜法固色譜法v適用范圍：適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性v缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾18

8、液液液分配色譜法液分配色譜法固定相與流動(dòng)相：均為液體（互不相溶），其中固定相是將特殊的液態(tài)物質(zhì)涂于或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面，常用的載體材料為全多孔型或薄殼型（表面多孔）微粒硅膠吸附劑基本原理：根據(jù)被分離組分在固定相和流動(dòng)相中溶解度不同而分離，分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程適用范圍：水溶性和油溶性樣品，極性和非極性化合物，離子型和非離子型化合物等19液液液分配色譜法液分配色譜法優(yōu)點(diǎn)：色譜柱再生方便，樣品負(fù)載量大，重現(xiàn)性好，分離效果好等缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相可克服上述缺

9、點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（7080%）。 20化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法 (bonded phase chromatography；BPC)化學(xué)鍵合固定相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相（）和反相（reversed phasereversed phase，RPRP）鍵合相色譜法）鍵合相色譜法21正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性分離機(jī)制：分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解 吸附：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、

10、誘導(dǎo)力或氫作用力固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動(dòng)相：相對(duì)極性小的疏水性溶劑（烷烴類如正己烷、環(huán)己烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、二氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間22正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱適用范圍：中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）23反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性分離機(jī)制：疏溶劑理論-溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。 排斥力強(qiáng)，作用時(shí)間，k，組分tR 排斥力弱，作用時(shí)間，k，組分tR固定相：極性小的烷基鍵合相（

11、如C8柱，C18柱）24反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜流動(dòng)相：水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間出柱順序：極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適用范圍：非極性和極性較弱的化合物，占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右25化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：1、適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過(guò)控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過(guò)改變流動(dòng)相的組成合乎種類來(lái)有效地分離非極性、極性和離子型化合物。2、由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶

12、來(lái)的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。3、鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。4、固定相柱效高，使用壽命長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好。26高效液相色譜儀組成組成v輸液系統(tǒng)v進(jìn)樣器v色譜柱v檢測(cè)器v組分收集器v數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)27進(jìn)樣器進(jìn)樣器停留進(jìn)樣裝置、手動(dòng)進(jìn)樣閥（六通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置28 檢測(cè)器檢測(cè)器示差折光化學(xué)檢測(cè)器 紫外吸收檢測(cè)器 紫外一可同分光光度檢測(cè)器 二極管陣列紫外檢測(cè)器 熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器 29專屬型檢測(cè)器 它對(duì)不同組成的物質(zhì)響應(yīng)差別極大，因此只能選擇性的檢測(cè)某些物質(zhì)，如紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和電導(dǎo)檢測(cè)器。通用型檢測(cè)器 它對(duì)大多

13、數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)相差不大幾乎適用于所有物質(zhì)，如示差折光化學(xué)檢測(cè)器 。但它的靈敏度低，受溫度影響波動(dòng)大、使用時(shí)有一定局限性。30紫外吸收檢測(cè)器 簡(jiǎn)稱紫外檢測(cè)器（ ultraviolet absorption detector ，UV），是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)器。 因?yàn)榇蟛糠殖Ｒ?jiàn)有機(jī)物質(zhì)和部分無(wú)機(jī)物質(zhì)都具有紫外吸收性質(zhì)，所以該檢測(cè)器是液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，幾乎所有液相色譜儀都配置了這種檢測(cè)器。 它不僅有較好的選擇性和較高的靈敏度，而且對(duì)環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成變化和流速波動(dòng)不太敏感，因此既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫。31檢測(cè)原理：朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律

14、，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=Cl特點(diǎn)：靈敏度較高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度洗脫，不破壞樣品，應(yīng)用廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用 ）局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng) 專屬型、濃度型檢測(cè)器32示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器 v凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)v糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)v這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7gml）v流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)33熒光檢測(cè)器

15、熒光檢測(cè)器 v凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比v只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定 柱前或柱后衍生v其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-1210-14gml）v痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測(cè)均可采用 34從色譜流出曲線中可以得出許多重要信息：從色譜流出曲線中可以得出許多重要信息： 樣品所含組分的最少個(gè)數(shù)； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面積）； 分離效能（保留值及區(qū)域?qū)挾龋?兩相選擇的依據(jù)（峰間距離）35HPLC定性分析的基本原理定性分析的基本原理 在同一個(gè)色譜條件下，不同樣品內(nèi)所含有的同一物質(zhì)，在色譜柱內(nèi)

16、具有相同的作用機(jī)理和平衡參數(shù)，因此，具有相同的色譜保留行為，反映在色譜圖上就是有相同的保留時(shí)間，這就是高效液相色譜儀定性的依據(jù)。36 但是，由于色譜柱內(nèi)，被分析物質(zhì)和固定相、流動(dòng)相之間作用的復(fù)雜性，以及色譜柱的分離能力-柱效的局限，有些物質(zhì)是不能分離或是完全分開(kāi)，因此出現(xiàn)在同一或是相近的保留時(shí)間內(nèi)。色譜的這種定性的局限性概括為：在同一色譜條件下，同一物質(zhì)具有相同的保留時(shí)間，而同一保留時(shí)間并不說(shuō)明是同一物質(zhì)。 37 為提高高效液相色譜的定性能力，通常使用一些具有較強(qiáng)定性能力的檢測(cè)器，如：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）,液相色譜-紫外可見(jiàn)光掃描檢測(cè)器（HPLC-PDA），液相色譜-紅外、核磁聯(lián)

17、用儀等。通過(guò)這些檢測(cè)器可對(duì)每一組分進(jìn)行定性分析。38定量分析的基本原理定量分析的基本原理 當(dāng)一個(gè)樣品在色譜柱內(nèi)被分離成幾個(gè)組分以后，每個(gè)組分依次流經(jīng)檢測(cè)器，經(jīng)檢測(cè)得到相應(yīng)的色譜圖。色譜圖中各個(gè)組分的響應(yīng)值，也就是色譜峰的一些性質(zhì)如峰高、峰面積是定量分析的基本依據(jù)。39 以常用的紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器為例：由于紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器(UV-Vis檢測(cè)器)與分光光度計(jì)的基本原理一致，在一定的濃度范圍內(nèi)都服從比爾定律（Beers law）: a=ebc 其中，a：吸光度；e：該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)；b：光程；c：該物質(zhì)的濃度。 40在一定的濃度范圍內(nèi)，有 C=kA+b C：樣品中該物質(zhì)的濃度，A:該物質(zhì)對(duì)應(yīng)的

18、峰面積，k、b為常數(shù)。 也就是說(shuō)，被分析樣品內(nèi)某一物質(zhì)的濃度和該物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的峰面積成正比，這就是高效液相色譜定量分析的基本原理。41在藥物分析中的應(yīng)用 1.在鑒別中的應(yīng)用在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中，保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別。如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定：在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致。頭抱拉定、頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。 422.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛。主要用

19、于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查。 “有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測(cè)。 若雜質(zhì)是已知的，又有雜質(zhì)的對(duì)照品，可用雜質(zhì)對(duì)照品做對(duì)照進(jìn)行檢查。若雜質(zhì)是未知的，可以采用主成分自身對(duì)照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查。433在含量測(cè)定中的應(yīng)用在含量測(cè)定中的應(yīng)用 用高效液相色譜法測(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對(duì)測(cè)定的干擾。中藥材及其制劑組成復(fù)雜，基中不少有效成分的含量測(cè)定也越來(lái)越多地采用了高效液相色譜法。4.手性分離手性分離445.在血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用在血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用 用HPLC測(cè)定可疑中毒病人血中藥物濃度具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，可有效地幫助臨床醫(yī)生確診，快速有效地救治患者，對(duì)提高