外植體的選擇消毒和接種

1、會計學(xué)1外植體的選擇消毒和接種外植體的選擇消毒和接種目的要求掌握選擇外植體的方法；熟練掌握接種方法。第一節(jié) 外植體的選擇 外植體的來源是決定植物組織培養(yǎng)成敗的一個重要因素。根據(jù)植物細(xì)胞全能性的的理論，任何細(xì)胞、組織和器官都可以作為外植體，但實際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大區(qū)別。第一，選擇優(yōu)良的種質(zhì)； 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定或特殊的基因型。對材料的選擇要有

2、明確的目的，具有一定的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。第二，選擇健壯的植株； 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功。此現(xiàn)象可能謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功。此現(xiàn)象可能是由于外植體內(nèi)部的植物激素水平能夠在接種后得以維持是由于外植體內(nèi)部的植物激素水平能夠在接種后得以維持所致。所致。第三，選擇合適的部位； 植物組織培養(yǎng)幾乎在植物體的各個部位都獲得

3、了成功，植物組織培養(yǎng)幾乎在植物體的各個部位都獲得了成功，這些部位包括：莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表這些部位包括：莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的儲藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、莖、子葉、鱗莖、胚皮、塊莖的儲藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、莖、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。珠和花藥等。 但是不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條但是不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化率高，有的部位很難件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化率高，有的部位很難脫分化，或者在分化頻率很低。脫分化，或者在分化頻率很低。第四，取材季節(jié)合理； 對于大多數(shù)植物而言，應(yīng)在其生長的

4、季節(jié)開始采對于大多數(shù)植物而言，應(yīng)在其生長的季節(jié)開始采樣。在生長末期或已進(jìn)入休眠期時取樣，外植體可能樣。在生長末期或已進(jìn)入休眠期時取樣，外植體可能對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)，較難成活。對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)，較難成活。第五，考慮器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡； 一般認(rèn)為，沿著植物的主軸，越一般認(rèn)為，沿著植物的主軸，越向上的部分所形成的器官的生長時間向上的部分所形成的器官的生長時間越短，其生理年齡也相應(yīng)越老，越接越短，其生理年齡也相應(yīng)越老，越接近發(fā)育上的成熟，越易形成花器官。近發(fā)育上的成熟，越易形成花器官。反之，越向基部，其生理年齡越小。反之，越向基部，其生理年齡越小。 一般情況下，幼年組織比老年組一般情況

5、下，幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力。隨著組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力。隨著組織年齡的增加，器官的再生能力逐漸織年齡的增加，器官的再生能力逐漸減弱甚至完全失去再生能力。減弱甚至完全失去再生能力。第六，選擇大小合適的外植體； 建立無菌材料時，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材建立無菌材料時，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5 1.00cm之間。如之間。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。果是胚胎培養(yǎng)或

6、脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。第二節(jié) 外植體的消毒、接種 從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理。 已消毒的外植體經(jīng)無菌操作，接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。外植體接種的一般步驟：外植體的修剪流水沖洗浸潤滅菌接種 將采來的植物材料除去不用的部分。 要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70酒精、消毒液、無菌水、手表等。1.將需要的部分仔細(xì)洗干凈，可用適當(dāng)?shù)乃⒆铀⑾础?.把材料切割成適當(dāng)大小。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時。3.易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。4.洗衣粉、

7、吐溫可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)。 已消毒的外植體經(jīng)無菌操作，接到培養(yǎng)基上。接種材料預(yù)處理接種材料預(yù)處理:(1)(1)接種材料預(yù)培養(yǎng)接種材料預(yù)培養(yǎng)(2)(2)就地套袋就地套袋(3)(3)接種材料修整接種材料修整(4)(4)沖洗沖洗接種前準(zhǔn)備接種前準(zhǔn)備:123456外植體消毒外植體消毒:外植體剪切外植體剪切:1.葉片葉片0.5cm0.5cm2.微莖尖微莖尖0.2-0.5mm3.帶節(jié)莖段帶節(jié)莖段0.5-1.0cm4.芽叢分離芽叢分離接種操作接種操作:橫插法與豎插法橫插法與豎插法: 接種時有一個敞口的過程，是極易引起污染的時期，主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，因此，接種室要

8、嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用13的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70的酒精或3的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。接種室要嚴(yán)格消毒無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：接種前外植體消毒順序接種前外植體消毒順序:第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組培苗的生長和發(fā)育。 不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25下的高。 桃胚在25條件進(jìn)行一定時間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35處理草莓的

9、莖尖分生組織35天，可得到無病毒苗。 一、溫度 溫度是組織培養(yǎng)過程中的重要因素。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長分化表現(xiàn)良好， 大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在2327之間進(jìn)行，很多研究者采用了25的恒溫條件。低于15時培養(yǎng)，組織會表現(xiàn)生長停止，高于35時對生長不利。 不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是20、月季是2527、番茄是28。 溫度不僅影響組培苗的生長速度， 也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成28為最好， 在12以下，33以上形成率皆最低。 二、光照組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一。1光照強(qiáng)度 從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體、細(xì)胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影響。

10、一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。2光質(zhì) 光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下， 幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3光周期 試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)， 最常用的周期是16小時的光照， 小時的黑暗，研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織， 在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)， 尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。 環(huán)境的

11、相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)， 一般要求的相對濕度， 常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行；濕度過高時，易引起棉塞長霉，造成污染。 三、濕度 濕度的影響包括培養(yǎng)容器和環(huán)境的濕度條件。 容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。 前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量， 否則，將使培養(yǎng)基干硬，不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基， 導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導(dǎo)致生長發(fā)育受影響。 培養(yǎng)基中添加的鹽類、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇

12、類高分子化合物，影響到滲透壓的變化。 個大氣壓對生長有促進(jìn)作用，個大氣壓以上就對生長有阻礙作用， 個大氣壓生長就完全停止，個大氣壓細(xì)胞就不能生存。 四、滲透壓 五、pH值 p值適度因植物材料而異，不同的材料對培養(yǎng)基最適p值的要求也是不同的，大多在.左右，一般培養(yǎng)基皆掌握在.，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。表表 不同植物材料的最適不同植物材料的最適pH值值 一般來說當(dāng)p值高于.時，培養(yǎng)基完全變硬；低于時，瓊脂不能很好地凝固。由于高溫滅菌會降低p值（約.個p）， 故在配制時常提高p值.單位。 p值大小調(diào)整可用.的a和.的l來調(diào)整。ml的a可使p值升高.單位，ml的HCL可使值降低.單位。調(diào)節(jié)時一

13、定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?p值也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣， 后者較高一些。 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素。 瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥， 夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度,以利于發(fā)根。 培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。 液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。 六、氣體真菌污染假設(shè)污染率為假設(shè)污染率為95%： 100塊材料，接種于塊材料，接種于100支試管，即支試管，即1 1塊塊/ /支支。得率為：得率為：P=（1-95%）100=5塊

14、無菌材料塊無菌材料 200塊材料，接種于塊材料，接種于100支試管，即支試管，即2 2塊塊/ /支支。P1（2污）污）=95% 95%=90.25%P2（1污污1得或得或1得得1污）污）=2 95%5%=9.5%P3（2得）得）=5% 5%=0.25%若得到若得到1支試管的無菌材料，至少要接種：支試管的無菌材料，至少要接種：1/0.25%=400支，即接種支，即接種800塊材料，能得塊材料，能得2塊無菌塊無菌材料。材料。 若按若按3 3塊塊/ /支支接種，需做接種，需做8000支試管培養(yǎng)基，接入支試管培養(yǎng)基，接入2.4萬塊萬塊材料，才能有材料，才能有1支試管的（得支試管的（得3塊）無菌材料。塊

15、）無菌材料。白花苗1.蘋果無融合生殖矮生砧木的組織培養(yǎng)2.矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)及植株再生研究3.水稻花藥組織培養(yǎng)中綠苗率的提高4.分蘗洋蔥的組織培養(yǎng)與快速繁殖5.半夏組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究6.月季的莖段培養(yǎng)與快繁7.櫻桃番茄的組織培養(yǎng)與快速繁殖8.哈密瓜組織培養(yǎng)和離體快繁9.羽扇豆的組織培養(yǎng)10.花燭的組織培養(yǎng)與快速繁殖11.柿樹的葉片培養(yǎng)和快速繁殖12.菊苣花瓣的組織培養(yǎng)文獻(xiàn)資料文獻(xiàn)資料:復(fù)習(xí)思考題：復(fù)習(xí)思考題：1選擇外植體時應(yīng)注意的問題有哪些？選擇外植體時應(yīng)注意的問題有哪些？2外植體消毒的整個過程。外植體消毒的整個過程。3接種時需要注意哪些問題？接種時需要注意哪些問題？第一，選擇優(yōu)良的種質(zhì)； 無論

16、是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。第二，選擇健壯的植株； 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組

17、織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功。此現(xiàn)象可能謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功。此現(xiàn)象可能是由于外植體內(nèi)部的植物激素水平能夠在接種后得以維持是由于外植體內(nèi)部的植物激素水平能夠在接種后得以維持所致。所致。第三，選擇合適的部位； 植物組織培養(yǎng)幾乎在植物體的各個部位都獲得了成功，植物組織培養(yǎng)幾乎在植物體的各個部位都獲得了成功，這些部位包括：莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表這些部位包括：莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的儲藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、莖、子葉、鱗莖、胚皮、塊莖的儲藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、莖、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。珠和花藥等。 但是不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條但是不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化率高，有的部位很難件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化率高，有的部位很難脫分化，或者在分化頻率很低。脫分化，或者在分化頻率很低。 培養(yǎng)基中添加的鹽類、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇類高分子化合物，影響到滲透壓的變化。 個大氣壓對生長有促進(jìn)作用，個大氣壓以上就對生長有阻礙作用， 個大氣壓生長就完全停止，個大氣壓細(xì)胞就不能生存。 四、滲透壓 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素。 瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基