基因工程2載體

1、會計學(xué)1基因工程基因工程2載體載體第1頁/共39頁pBR322plasmidF. BolivarR. L. RodriguezBacterial ResistancepBR322酶切圖譜第2頁/共39頁2.pUC系統(tǒng)美國加利福尼亞大學(xué)的科學(xué)家J. Messing和J. Vieria于1987年首先構(gòu)建 來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點 氨芐青霉素的抗性基因 大腸桿菌-半乳糖酶基因的啟動子及其編碼的-肽鏈基因（lacZ） 位于lacZ基因內(nèi)的一段MCS區(qū)段第3頁/共39頁第4頁/共39頁第5頁/共39頁2.pUC系統(tǒng)X-gal X-gal 溴氯吲哚溴氯吲哚+ + -半乳糖苷半乳糖苷-藍(lán)白斑篩選插入

2、片段插入片段 無酶活性無酶活性 白斑白斑未插入片段未插入片段 有酶活性有酶活性 藍(lán)斑藍(lán)斑-半乳糖苷酶半乳糖苷酶第6頁/共39頁經(jīng) Taq DNA 聚合酶擴增后的 PCR 產(chǎn)物末端都帶有單個 A 第7頁/共39頁 食品級微生物 適合于真核基因表達(dá) 基因產(chǎn)物外分泌第8頁/共39頁七、酵母菌質(zhì)粒載體七、酵母菌質(zhì)粒載體 多數(shù)酵母中含有一種能獨立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA，稱為2質(zhì)粒，長約6.3kb，有單一的復(fù)制起始點和一個自主復(fù)制功能區(qū)域（ARS片段）。 整合型、復(fù)制型、附加型和穩(wěn)定型整合型、復(fù)制型、附加型和穩(wěn)定型等類型。 含有含有E.coliE.coli質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。含有酵母的篩

3、選標(biāo)記（如含有酵母的篩選標(biāo)記（如LEU2LEU2）具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點。具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點。2.酵母菌質(zhì)粒載體的特點酵母菌質(zhì)粒載體的特點1.酵母菌質(zhì)粒載體的類型酵母菌質(zhì)粒載體的類型第9頁/共39頁TypeNameDescriptionbacterial originColE1ColE1 (pUC-type) origin of replicationpromoterGal1-10 promoterGal1-10 yeast promoterselectable markerampRampicillin resistance geneselectable

4、 markerchlRchloramphenicol resistance gene LOST in recombined (with insert) formselectable markerURA3URA3 auxotrophy selectable marker (yeast)yeast centromereCEN4yeast centromeric sequenceyeast originARS1ARS1 yeast origin of replication酵母菌酵母菌穩(wěn)定型穩(wěn)定型質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 著絲粒著絲粒第10頁/共39頁第11頁/共39頁第12頁/共39頁第13頁/共39頁一

5、、一、 噬菌體載體噬菌體載體 1. 噬菌體結(jié)構(gòu)特點噬菌體結(jié)構(gòu)特點: 線性雙鏈DNA分子可在E.coli中大量繁殖具非必需區(qū)(約1/3長度）兩端具12個核苷酸單鏈互補粘性末端 第14頁/共39頁第15頁/共39頁噬菌體線性噬菌體線性DNA分子的粘性末端及其環(huán)化作用分子的粘性末端及其環(huán)化作用（a）具有互補單鏈末端（粘性末端）的 DNA分子。（b）當(dāng)進(jìn)入宿主細(xì)胞后，通過粘性末端之間的堿基配對作用實現(xiàn)的線性分子的環(huán)化作用，由此形成的雙鏈區(qū)叫做coscos位點位點GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACGcos5-P5-P33粘性末端粘性末端環(huán)化作用環(huán)化作用（a）（b）第16頁/共39頁

6、酶切點太多酶切點太多 5 5個個BamH1BamH1位點，位點，6 6個個BglBgl位點，位點，5 5個個EcoREcoR位點。位點。 野生型只能接納一定長度的野生型只能接納一定長度的DNADNA。 噬菌體的噬菌體的75-105%75-105%，只能接納，只能接納49kb49kb5%=2.45kb5%=2.45kb的的DNADNA。 噬菌體的改造：噬菌體的改造： 切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（15-23Kb15-23Kb）；）； 去除過多的酶切位點，每種酶只留去除過多的酶切位點，每種酶只留1-21-2個切口；個切口； 增加選擇標(biāo)記基因

7、（增加選擇標(biāo)記基因（selectable markerselectable marker）；）； 建立建立DNADNA的體外包裝。的體外包裝。第17頁/共39頁主要外殼蛋白質(zhì)主要外殼蛋白質(zhì)是基因是基因E E的產(chǎn)物的產(chǎn)物頭部前體連環(huán)DNA基因A的產(chǎn)物在cos位點切割噬菌體DNA包含在外殼中的基因D的產(chǎn)物基因W和FII的產(chǎn)物組裝蛋白質(zhì)加完整的尾部噬菌體的包裝過程噬菌體的包裝過程第18頁/共39頁supsup- -細(xì)菌細(xì)菌頭部基因（琥珀突變型）尾部基因（琥珀突變型）轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成組裝尾部所需要的組分“無頭部”的提取物組裝頭部所需要的組分“無尾部”的提取物溫育完整的噬菌體轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成T4噬菌

8、體的體外包裝DNADNA的體外包裝的體外包裝體外包裝的重組DNA比裸露的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率高100-10000倍第19頁/共39頁4.4.凱倫噬菌體載體克隆過程凱倫噬菌體載體克隆過程第20頁/共39頁5.噬菌體載體優(yōu)點噬菌體載體優(yōu)點:用途用途: :主要用于建立真核生物的基因文庫感染高效:比質(zhì)粒高百倍 容量大:可達(dá)15Kb(不得超過原來長度的105%,不得短于原來長度的75%) 易操作,易保藏 第21頁/共39頁二、二、柯斯柯斯( (COS)COS)載體載體( (cosmid)cosmid) 1.柯斯載體的組成柯斯載體的組成 帶有抗藥性標(biāo)記 帶有質(zhì)粒的復(fù)制起始點 帶有多個限制酶的單一切點

9、帶有噬菌體粘性末端片段 由質(zhì)粒和粘性末端“尾巴”兩部分組成。2.柯斯載體的特點柯斯載體的特點 第22頁/共39頁3.cosmid3.cosmid載體的優(yōu)點載體的優(yōu)點 能象DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 可以裝載比質(zhì)?；駾NA大得多的外源DNA片段 cos區(qū) 1.7 kb+質(zhì)粒部分 3.3kb 46.5Kb 外源DNA 由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。 第23頁/共39頁第24頁/共39頁利用柯斯載體載體進(jìn)行基因克隆的一般程序第25頁/共39頁第26頁/共39頁三、三、M13M13噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體 1.M131.M13的特性的特性:環(huán)

10、狀,單鏈DNA,6.407Kb 第27頁/共39頁2.M13噬菌體作為載體噬菌體作為載體優(yōu)越性優(yōu)越性 單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡稱RFDNA； 不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌； 單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的大小制約的，不存在包裝限制問題； 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。第28頁/共39頁第29頁/共39頁2.M132.M13載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 第30頁/共39頁其基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因P中，使外源DNA片段對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面。 第31

11、頁/共39頁第32頁/共39頁第33頁/共39頁質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删w克隆克隆DNADNA大片段大片段* *+ + +- -構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建基因組文庫- -+ + +- -構(gòu)建構(gòu)建DNADNA文庫文庫+ +- - - -常規(guī)的亞克隆化常規(guī)的亞克隆化+ +- - - -構(gòu)建新型的構(gòu)建新型的DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)+ +- - - -序列分析序列分析+ +- - -+ +單鏈探針單鏈探針- - - -+ +外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+ +- - - -* * 外源外源DNADNA如超過如超過10kb10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和，則重組質(zhì)粒

12、的轉(zhuǎn)化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低四種常用載體的比較四種常用載體的比較第34頁/共39頁2.pUC系統(tǒng)美國加利福尼亞大學(xué)的科學(xué)家J. Messing和J. Vieria于1987年首先構(gòu)建 來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點 氨芐青霉素的抗性基因 大腸桿菌-半乳糖酶基因的啟動子及其編碼的-肽鏈基因（lacZ） 位于lacZ基因內(nèi)的一段MCS區(qū)段第35頁/共39頁2.pUC系統(tǒng)X-gal X-gal 溴氯吲哚溴氯吲哚+ + -半乳糖苷半乳糖苷-藍(lán)白斑篩選插入片段插入片段 無酶活性無酶活性 白斑白斑未插入片段未插入片段 有酶活性有酶活性 藍(lán)斑藍(lán)斑-半乳糖苷酶半乳糖苷酶第36頁/共39頁經(jīng) Taq DNA 聚合酶擴增后的 PCR 產(chǎn)物末端都帶有單個 A 第37頁/共3